Λειτουργική και μορφολογική ανάλυση μυών με γενετικά τροποποιημένους πληθυσμούς κατά την ανάπτυξη του φλοιού των εγκεφαλικών ημισφαιρίων

Abstract

Part I Developmental changes in early postnatal inhibitory circuits in the medial prefrontal cortex compared to primary somatosensory cortex of the mouse.The prefrontal cortex (PFC) controls higher cognitive abilities severely impaired in neurodevelopmental disorders. The PFC is characterised by delayed maturation extending until the end of adolescence. The cellular mechanisms controlling the early development of prefrontal circuits are still largely unresolved. Our study delineates the developmental cellular processes in vitro that are on-going in the mouse medial PFC (mPFC) during the second and third postnatal weeks (P10 and P20) or neonatal and pre-juvenile periods, respectively, and compares them to those in the barrel cortex (BC). We show that the basal synaptic transmission decreases with age as a result of a concurrent reduction of spontaneous postsynaptic excitatory currents and increase of inhibitory ones. Although total cell density in the mPFC is decreased from the second to third postnatal week, the number of parvalbumin (PV) and serotonin receptor (5HT3aR)-positive interneurons is increased. Furthermore, our data indicate that increased GABAA receptor activity leads to increased basal synaptic transmission of neonatal mPFC, showing that the effect of GABA is not inhibitory in this time window in mPFC in contrast to BC. Supporting evidence comes form results describing the expression of KCC2, an integral transporter involved in the switch between depolarizing and hyperpolarizing action of GABA. KCC2 levels are decreased in neonatal mPFC compared to both pre-juvenile PFC and BC at both ages. In parallel, the intrinsic properties of both interneurons and pyramidal are altered from P10 to P20 in both brain areas. Finally, we show that all the above developmental events relate to increased network activity in the mPFC from the second to the third postnatal week, in vivo. Part II Mice with decreased number of interneurons exhibit aberrant spontaneous and oscillatory activity in the barrel cortex.GABAergic (γ-aminobutyric acid) neurons are inhibitory neurons and protect neural tissue from excessive excitation. Cortical GABAergic neurons play a pivotal role for the generation of synchronized cortical network oscillations. Imbalance between excitatory and inhibitory mechanisms underlies many neuropsychiatric disorders and is correlated with abnormalities in oscillatory activity, especially in the gamma frequency range (30-80Hz). We investigated the functional changes in cortical network activity in response to developmentally reduced inhibition in the adult mouse barrel cortex (BC). We used a mouse model that displays ~50% fewer cortical interneurons due to the loss of Rac1 protein from Nkx2.1/Cre-expressing cells (Rac1 conditional knockout (cKO) mice), to examine how this developmental loss of cortical interneurons may affect basal synaptic transmission, synaptic plasticity, spontaneous activity and neuronal oscillations in the adult BC. The decrease in the number of interneurons increased basal synaptic transmission, as examined by recording field excitatory postsynaptic potentials (fEPSPs) from layer II networks in the Rac1 cKO mouse cortex, decreased long-term potentiation (LTP) in response to tetanic stimulation but did not alter the pair-pulse ratio (PPR). Furthermore, under spontaneous recording conditions, Rac1 cKO brain slices exhibit enhanced sensitivity and susceptibility to emergent spontaneous activity. We also found that this developmental decrease in the number of cortical interneurons results in local neuronal networks with alterations in neuronal oscillations, exhibiting decreased power in low frequencies (delta, theta, alpha) and gamma frequency range (30-80Hz) with an extra aberrant peak in high gamma frequency range (80-150Hz). Therefore, our data show that disruption in GABAergic inhibition alters synaptic properties and plasticity, while it additionally disrupts the cortical neuronal synchronization in the adult BC.

Μέρος Ι. Αναπτυξιακές αλλαγές κατά την πρώιμη μεταγεννετική περίοδο του ανασταλτικού κυκλώματος του έσω προμετωπιαίου φλοιού σε σχέση με τον κύριο σωματοαισθητικό φλοιό.Ο προμετωπιαίος φλοιός (prefrontal cortex, PFC) ελέγχει ανώτερες γνωστικές ικανότητες που έχουν σοβαρή βλάβη στις νευροαναπτυξιακές διαταραχές. Ο PFC χαρακτηρίζεται από καθυστερημένη ωρίμανση που εκτείνεται μέχρι το τέλος της εφηβείας. Οι κυτταρικοί μηχανισμοί που ελέγχουν την πρώιμη ανάπτυξη των κυκλωμάτων του προμετωπιαίου φλοιού παραμένουν σε μεγάλο βαθμό αδιευκρίνιστοι. Η μελέτη μας αναλύει τις αναπτυξιακές κυτταρικές διεργασίες in vitro που βρίσκονται σε εξέλιξη στον έσω PFC (medial PFC, mPFC) του ποντικιού από τη δεύτερη και την τρίτη μεταγεννητική εβδομάδα ή νεογνική και προ-νεανική, αντίστοιχα, συγκριτικά με αυτές στο βαρελοειδή φλοιό (barrel cortex, BC). Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η βασική συναπτική μεταβίβαση μειώνεται με την ηλικία ως αποτέλεσμα της ταυτόχρονης μείωσης των αυθόρμητων μετασυναπτικών διεγερτικών ρευμάτων και της αύξησης των ανασταλτικών. Αν και η ολική κυτταρική πυκνότητα του mPFC μειώνεται από την δεύτερη στην τρίτη μεταγεννητική εβδομάδα, ο αριθμός των ενδονευρώνων που εκφράζουν την παρβαλβουμίνη (parvalbumin, PV) και τον υποδοχέα της σεροτονίνης (5HT3aR) αυξάνεται. Επιπλέον, τα δεδομένα μας υποδεικνύουν ότι η αυξημένη δραστικότητα του GABAA υποδοχέα οδηγεί σε αυξημένη βασική συναπτική μεταβίβαση στο νεογνικό mPFC, δείχνοντας ότι η επίδραση του GABA δεν θα μπορούσε να είναι ανασταλτική σε αυτό το χρονικό παράθυρο στον mPFC. Ένα πρόσθετο στοιχείο για την υποστήριξη αυτής της υπόθεσης είναι η έκφραση του KCC2, ενός μεταφορέα που εμπλέκεται στη μεταστροφή μεταξύ της εκπολωτικής σε υπερπολωτικής δράσης του GABA. Η έκφραση του KCC2 είναι μειωμένη στο νεογνικό mPFC σε σύγκριση με το προ-νεανικό mPFC και το BC, σε αμφότερα χρονικά σημεία. Παράλληλα, οι εγγενείς ιδιότητες των ενδονευρώνων μεταβάλλονται με τέτοιο τρόπο ώστε η ωρίμανσή τους να ρυθμίζεται από την ηλικία, ενώ οι αλλαγές στις ιδιότητες των πυραμιδικών νευρώνων είναι πιο μικρές. Τέλος, δείχνουμε ότι όλα τα 9 παραπάνω αναπτυξιακά συμβάντα σχετίζονται με αυξημένη δραστηριότητα των νευρικών δικτύου στο mPFC από τη δεύτερη έως την τρίτη μεταγεννητική εβδομάδα, in vivo. Μέρος ΙΙ Μύες με μειωμένο αριθμό ενδονευρώνων επιδεικνύουν διαταραχές στην αυθόρμητη δραστηριότητα και στη ρυθμική δραστηριότητα των δικτύων του σωματαισθητικού /βαρελοειδούς φλοιού.Οι GABAεργικοί ενδονευρώνες είναι οι κύριοι ανασταλτικοί νευρώνες και προστατεύουν τους εγκεφαλικούς ιστούς από την υπερβολική διέγερση. Οι GABAεργικοί ενδονευρώνες του φλοιού έχουν σημαντικό ρόλο για την παραγωγή συγχρονισμένης ρυθμικής φλοιικής δραστηριότητας. Πολλές νευροψυχιατρικές διαταραχές συσχετίζονται με ανισορροπία ανάμεσα στους μηχανισμούς διέγερσης και αναστολής σε συνδυασμό με μεταβολές στη ρυθμική δραστηριότητα των νευρικών δικτύων, ειδικά σε γάμμα συχνότητες (30-80 Hz). Ερευνήσαμε τις αλλαγές της δραστηριότητας των φλοιικών δικτύων όταν απουσιάζει η αναστολή στον ενήλικο βαρελοειδή φλοιό (barrel cortex-BC) μυών. Χρησιμοποιήσαμε γενετικά τροποποιημένα ζώα ως πειραματικά μοντέλα-εργαλεία με 50% μείωση των ενδονευρώνων του ώριμου φλοιού, εξαιτίας της απαλοιφής της πρωτεΐνης Rac1 στους ενδονευρώνες που εκφράζουν το NKx2.1/Cre κατά την εμβρυική ηλικία [Rac1 conditional knockout (cKO)]. Σκοπός μας ήταν να εξετάσουμε πώς η αναπτυξιακή μείωση των φλοιικών ενδονευρώνων επηρεάζει τη βασική συναπτική μεταβίβαση, την συναπτική πλαστικότητα, την αυθόρμητη δραστηριότητα και τη ρυθμική δραστηριότητα στον ώριμο BC. Καταγραφές πεδίου διεγερτικών μετασυναπτικών δυναμικών (fEPSPs) είδαν ότα τα δίκτυα της φλοιικής στοιβάδας ΙΙ των Rac1cKO ζώων χαρακτηρίζονται από αυξημένη βασική συναπτική μεταβίβαση, μειωμένη μακροχρόνια ενδυνάμωση ( long-term potentiation, LTP) μετά από ένα έντονο ερεθισμό και ανεπηρέαστη αναλογία συζευγμένων παλμών (pair-pulse ratio, PPR). Επιπλέον, καταγραφές αυθόρμητης δραστηριότητας σε φέτες εγκεφάλου των Rac1cKO ζώων έδειξαν αυξημένη ευαισθησία και επιδεκτικότητα στην εμφάνιση αυθόρμητης δραστηριότητας. Επίσης, βρήκαμε ότι στα ζώα με μειωμένο αριθμό των φλοιικών ενδονευρώνων, η δραστηριότητα των τοπικών νευρικών δικτύων εμφανίζει μειωμένη ισχύ στις χαμηλές συχνότητες (δέλτα 0-4 Hz, θήτα 4-8 Hz, άλφα 8-12 Hz) και στις γάμμα συχνότητες (30-80 Hz) με μία πρόσθετη παρεκκλίνουσα κορυφή στις υψηλές γάμμα συχνότητες (80-150 Hz). Συνεπώς, τα αποτελέσματά μας απέδειξαν ότι η διαταραχή της GABAεργικής αναστολής αλλάζει τις συναπτικές ιδιότητες και τη συναπτική πλαστικότητα, και επιπλέον διαταράσσει τον συγχρονισμό των νευρικών δικτύων του ενήλικου BC.