Μελέτη των μηχανισμών μοριακής σηματοδότησης και των αθηροπροστατευτικών δράσεων της HDL στα ενδοθηλιακά κύτταρα

Abstract

Numerous epidemiological studies have shown that low levels of High Density Lipoprotein Cholesterol (HDL-C) in the serum are a strong and independent risk factor for the development of Cardiovascular Diseases (CVDs). Furthermore, a great number of reports have revealed that HDL exerts pleiotropic functions protecting against the development of atherosclerosis, which is the leading cause of CVDs. However, drugs that were designed to increase HDL-C failed to counteract CVD risk in human clinical studies. In addition, recent studies showed that HDL isolated from patients with CVDs is “dysfunctional” and it is unable to exert its known anti-atherosclerotic functions. These findings indicate that only by raising HDL-C levels is not sufficient for atheroprotection, but it must be accompanied by the presence of functional HDL. Also, it should be mentioned that some drugs aiming to raise HDL-C levels caused significant side-effects, highlighting the complexity of the metabolic pathways as well as their poor understanding. The main goals of this PhD thesis were:•Chapter 1: To investigate the molecular mechanisms underlying the atheroprotective roles of HDL in the endothelium. For this purpose, in parts I and II, we focused on identifying genes targeted by HDL in endothelial cells as well as the mechanisms through which HDL regulates their expression, while in part III we studied the functionality of HDL isolated from patients with a chronic inflammatory disease (Ankylosing Spondylitis, AS).•Chapter 2: To identify novel transcription factors and miRNAs in the liver that control the expression of genes involved in the biogenesis of HDL. In part IV we studied the regulation of the transcription factor LXRα by the master hepatic transcription factor HNF-4α, while in part V we studied the role of the miRNA let-7b in the regulation of the expression of apolipoprotein E (apoE) gene.Endothelium injury or ‘dysfunctional’ endothelium has been associated with the initiation and the progression of the atherosclerotic plaque. HDL not only is a positive regulator of the physiological function of endothelium, but also protects endothelium against injury, while dysfunctional HDL is unable to promote these actions. For this purpose, in Chapter 1, we wanted to elucidate the molecular mechanisms underlying HDL functionality in endothelium. The genes that we focused on in the first two parts were derived from microarray data, which had been generated previously by our research group following the treatment of endothelial cells with reconstituted HDL containing the human apolipoprotein A-I (rHDL-AI). We studied the expression of these genes after treatment with natural HDL, which was isolated from transgenic mice expressing the human apoA-I gene (tgHDL).Specifically, in part I we studied the regulation of the Angiopoietin-like 4 (ANGPTL4) gene, which plays an important role in lipid metabolism and atherosclerosis. We observed that both natural HDL (tgHDL) and reconstituted HDL (rHDL-AI) were able to induce the expression of ANGPTL4. To investigate the molecular mechanisms through which tgHDL activates the expression of this gene, we utilized known inhibitors for signaling cascades and we observed that both the AKT and the p38-MAPK pathways are involved in this regulatory effect of tgHDL. Furthermore, by utilizing the separation of nuclear from cytoplasmic protein extracts technique as well as immunofluorescence, we revealed that tgHDL, through the AKT pathway, promotes the phosphorylation of the nuclear transcription factor Forkhead Box O1 (FOXO1) resulting in its translocation to the cytoplasm and, subsequently, its inactivation. By combining different experimental approaches to inactivate FOXO1 in endothelial cells followed by treatment with tgHDL, we identified that FOXO1 suppresses the expression of ANGPTL4, while the FOXO1-mediated inactivation by HDL results in the induction of ANGPTL4.In part II, we focused on the expression of the endothelial lipase (LIPG) gene, which mediates HDL catabolism. Initially, we observed that natural HDL (tgHDL) inhibited the expression of LIPG in contrast to reconstituted HDL (rHDL-AI) which induced its expression. We focused on the effect of tgHDL and we found that not only tgHDL inhibited the expression of LIPG but also prevented the induction of LIPG by growth deprivation (starvation). Silencing the expression of FOXO1 by utilizing a specific siRNA led to reduction of the LIPG mRNA levels indicating that FOXO1 is an important transcriptional activator of this gene in starvation conditions. TgHDL, by promoting FOXO1 transcriptional inactivation, inhibits LIPG expression. In addition to FOXO1 inactivation, tgHDL may inhibit the expression of an additional gene – still uncharacterized- in order to prevent LIPG-mediated induction by starvation.In part III we studied the functionality of HDL isolated from patients with Ankylosing Spondylitis (AS), a chronic inflammatory disease. We reported that HDL isolated from healthy people was able to phosphorylate AKT kinase, while HDL isolated from patients with AS showed reduced AKT phosphorylation indicating the existence of dysfunctional HDL in AS patients.Although HDL is synthesized extracellularly, liver is the main source of proteins participating in HDL biogenesis. Therefore, in Chapter 2 we used the human liver cell line, HepG2, in order to identify the mechanisms underlying the expression of genes involved in HDL metabolism.In part IV we studied the regulation of the transcription factor LXRα in the liver. LXRα (Liver X Receptor α) is a key regulator of lipid and cholesterol metabolism by controlling directly the expression of genes participating in these pathways (for instance ABCA1, ABCG1, SREBP etc.). We observed that the promoter of human LXRα gene (hLXRa) is activated by HNF-4α, a transcription factor expressed in the liver which regulates the expression of several liver-specific genes. By performing ChiP and DNAP analysis, we identified the binding site of HNF4a in the proximal region of the hLXRa promoter and specifically in the region from -50 to -40. Disruption of this site in the hLXRα promoter with site-specific mutagenesis abolished the transactivation by HNF-4α. Moreover, silencing of HNF-4α in HepG2 resulted in reduction of LXRα protein levels.In part V, we studied the ability of the micro-RNA let-7b to regulate the expression of apolipoprotein E (apoE) gene in HepG2 cells. ApoE is a crucial apolipoprotein since it not only mediates the clearance of triglyceride-rich lipoproteins from the circulation, but also participates in the biogenesis of HDL. Overexpression of let-7b in HepG2 caused a reduction in both mRNA and protein levels of apoE. However, let-7b overexpression did not affect the luciferase activity of a plasmid containing the 3’-UTR region of the mRNA of apoE. This observation indicates that let-7b does not regulate directly, though the 3’-UTR region, the expression of apoE. Furthermore, co-expression of a plasmid containing the (-500/+73) promoter of apoE with let-7b led to reduced luciferase activation confirming the indirect effect of let-7b in the regulation of apoE expression. Interestingly, we identified that let-7b also regulates the expression of apoA-I, the main protein of HDL. We found that let-7b overexpression resulted in a reduction of the mRNA levels of apoA-I as well as in the luciferase activity of a plasmid containing the (-1020/-24)-apoA-I promoter. Bioinformatic analysis in the mRNA region of the human apoA-I gene did not reveal any putative let-7b binding sites suggesting that apoA-I, similar to apoE, is regulated by let-7b independently of the 3’-UTR region.In conclusion, the findings from this PhD thesis provide new insights into the mechanisms that control HDL serum levels as well as its functionality. Genes found in the present study to mediate HDL functions in endothelial and liver cells may be of great diagnostic and/or therapeutic value in patients with low HDL or dysfunctional HDL such as patients with CVDs or chronic inflammatory diseases.

Πολυάριθμες επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι τα χαμηλά επίπεδα της λιποπρωτεΐνης υψηλής πυκνότητας (High Density Lipoprotein – HDL) στον ορό αποτελούν ισχυρό δείκτη κινδύνου για την ανάπτυξη Καρδιαγγειακών Νοσημάτων (ΚΝ). Παράλληλα, έχουν ανακαλυφθεί αρκετές προστατευτικές ιδιότητες της HDL απέναντι στην ανάπτυξη της αθηροσκλήρωσης, η οποία είναι η παθολογική αιτία των ΚΝ. Ωστόσο, σε ασθενείς με ΚΝ, η χρήση φαρμάκων που στόχευαν στην αύξηση της συγκέντρωσης της HDL στον ορό δεν οδήγησε σε μείωση του κινδύνου εμφάνισης καρδιαγγειακών γεγονότων. Επιπρόσθετα, πρόσφατες έρευνες ανέδειξαν ότι οι ασθενείς με KN φέρουν ‘μη λειτουργική/δυσλειτουργική’ HDL, η οποία αδυνατεί να πραγματοποιήσει τις φυσιολογικές προστατευτικές της δράσεις. Από αυτά τα δεδομένα προκύπτει πώς από μόνη της η αύξηση των επιπέδων της HDL δεν αρκεί για να παρέχει αθηροπροστασία αλλά πρέπει να συνοδεύεται και από την ύπαρξη λειτουργικής HDL. Παράλληλα, κάποια φάρμακα που στοχεύουν στην αύξηση των επιπέδων της HDL προκάλεσαν σημαντικές παρενέργειες στους ασθενείς αναδεικνύοντας την πολυπλοκότητα των μεταβολικών μονοπατιών αλλά και την ελλιπή, μέχρι σήμερα, κατανόησή τους. Οι ερευνητικοί στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν οι εξής: •Κεφάλαιο 1: Nα διευκρινιστούν οι μοριακοί μηχανισμοί μέσω τον οποίων η HDL επιφέρει την αθηρο-προστατευτική της δράση στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Για αυτό τον στόχο, στις Ενότητες I και II επικεντρωθήκαμε στην ανίχνευση γονιδίων-στόχων της HDL στα ενδοθηλιακά κύτταρα αλλά και στη μελέτη των μηχανισμών μέσω των οποίων πραγματοποιούνται οι συγκεκριμένες ρυθμίσεις, ενώ στην Ενότητα III, μελετήσαμε την λειτουργικότητα της HDL που έχει απομονωθεί από ασθενείς με μια χρόνια φλεγμονώδη νόσο (την αγκυλοποιητική σπονδυλίτιδα).•Κεφάλαιο 2: Να διερευνηθούν σε μοριακό επίπεδο νέα γονίδια και miRNAs που ρυθμίζουν την βιογένεση της HDL στα ηπατικά κύτταρα. Για τον σκοπό αυτόν, στην Ενότητα IV μελετήσαμε την ρύθμιση του γονιδίου του μεταγραφικού παράγοντα LXRα από τον ηπατικό μεταγραφικό παράγοντα HNF-4α, ενώ στην Ενότητα V μελετήσαμε τον ρόλο του miRNA let-7b στην ρύθμιση της απολιποπρωτεΐνης Ε (apoE) στα ηπατικά κύτταρα HepG2.Ο τραυματισμός ή ‘δυσλειτουργική’ δράση του ενδοθηλίου έχει συσχετιστεί με την έναρξη και ανάπτυξη της αθηρωματικής πλάκας. Η HDL αποτελεί ρυθμιστή της φυσιολογικής λειτουργίας του ενδοθηλίου και ενεργοποιεί μηχανισμούς προστασίας του μετά από τραύμα, ενώ η ‘δυσλειτουργική’ HDL δεν έχει αυτές τις δράσεις. Για αυτό τον λόγο, στον Κεφάλαιο 1 θέλαμε να ανιχνεύσουμε τους μοριακούς μηχανισμούς δράσης της φυσιολογικής HDL στο ενδοθήλιο. Τα γονίδια στα οποία επικεντρωθήκαμε στις δύο πρώτες ενότητες, αντλήθηκαν από microarray δεδομένα, τα οποία είχαν παραχθεί σε προηγούμενες μελέτες της ερευνητική μας ομάδας ύστερα από επίδραση ενδοθηλιακών κυττάρων με ανασυσταθείσα HDL που φέρει την ανθρώπινη απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (rHDL-AI). Εμείς μελετήσαμε την ανταπόκριση αυτών των γονιδίων ύστερα από επίδραση με φυσική HDL που απομονώθηκε από διαγονιδιακούς ποντικούς που εξέφραζαν την ανθρώπινη απολιποπρωτεΐνη-Α-Ι (tgHDL).Πιο συγκεκριμένα, στην ενότητα I επικεντρωθήκαμε στη ρύθμιση του γονιδίου της Angiopoietin-like 4 (ANGPTL4), το οποίο έχει σημαντικό ρόλο στον μεταβολισμό των λιπιδίων και στην αθηρωμάτωση. Παρατηρήσαμε ότι τόσο η φυσική HDL (tgHDL) όσο και η ανασυσταθείσα HDL (rHDL-AI) ενεργοποιούν την έκφραση της ANGPTL4. Για την ανίχνευση των μηχανισμών μέσω του οποίου η tgHDL ενεργοποιεί το συγκεκριμένο γονίδιο χρησιμοποιήσαμε γνωστούς αναστολείς κινασών και παρατηρήσαμε ότι η δράση της tgHDL γίνεται μέσω των μονοπατιών της AKT και της p38-MAPK. Επιπρόσθετα, με πειράματα διαχωρισμού πυρηνικών από κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες και ανοσοϊστοχημείας, παρατηρήσαμε ότι η tgHDL έχει την ικανότητα, μέσω του μονοπατιού της AKT, να επάγει την φωσφορυλίωση του πυρηνικού μεταγραφικού παράγοντα Forkhead Box O1 (FOXO1) με αποτέλεσμα την μετατόπισή του στο κυτταρόπλασμα και την απενεργοποίηση της μεταγραφικής του δράσης. Συνδυάζοντας διαφορετικές πειραματικές προσεγγίσεις για την απενεργοποίηση του FOXO1 στα ενδοθηλιακά κύτταρα με παράλληλη επίδραση ή όχι της tgHDL, είδαμε ότι o FOXO1 έχει ανασταλτικό ρόλο στην ενεργοποίηση του γονιδίου της ANGPTL4, όπου η απενεργοποίηση του από την HDL οδηγεί σε καταστολή της έκφρασης της ANGPTL4. Στην ενότητα II επικεντρωθήκαμε στην ρύθμιση του γονιδίου της ενδοθηλιακής λιπάσης (LIPG), η οποία εμπλέκεται στον καταβολισμό της HDL. Αρχικά παρατηρήσαμε ότι η φυσική HDL (tgHDL) μείωνε την έκφραση της LIPG σε αντίθεση με την rHDL-ΑΙ που την αύξανε. Επικεντρωθήκαμε στην δράση της tgHDL και διαπιστώσαμε ότι όχι απλά μείωνε την έκφραση της LIPG αλλά εμπόδιζε την ενεργοποίηση του γονιδίου σε συνθήκες έλλειψης θρεπτικού ορού (starvation). Πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης του FΟΧΟ1 με siRNAs οδήγησαν σε μείωση των επιπέδων της LIPG, αναδεικνύοντας ότι ο FOXO1 είναι σημαντικός για την ενεργοποίηση του συγκεκριμένου γονιδίου από το starvation αλλά και ότι η HDL μειώνει την έκφραση της LIPG μέσω της απενεργοποίησης του FOXO1. Επιπρόσθετα της δράσης του FOXO1, παρατηρήσαμε ότι η HDL εμποδίζει την έκφραση ενός επιπλέον γονιδίου ώστε να αναστείλει την ενεργοποίηση της LIPG από το starvation. Στην ενότητα III διερευνήσαμε την λειτουργικότητα της HDL που έχει απομονωθεί από ασθενείς με αγκυλοποιητική σπονδυλίτιδα (ΑΣ), μια χρόνια φλεγμονώδη νόσο. Παρατηρήσαμε ότι η HDL που είχε απομονωθεί από υγιή άτομα είχε την ικανότητα να φωσφορυλιώνει την κινάση ΑΚΤ ενώ αντίθετα, η HDL που απομονώθηκε από ασθενείς με ΑΣ οδήγησε σε μειωμένη φωσφορυλίωση της AKT στα ενδοθηλιακά κύτταρα υποδεικνύοντας την παρουσία μη-λειτουργικής HDL στους ασθενείς αυτούς.Παρότι η HDL συγκροτείται εξωκυττάρια, το ήπαρ αποτελεί την κύρια πηγή παραγωγής των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στη βιογένεση της HDL. Για αυτό τον λόγο, στο Κεφάλαιο 2 χρησιμοποιήσαμε κύτταρα ανθρώπινου ηπατοβλαστώματος HepG2 ώστε να μελετήσουμε τους μηχανισμούς ρύθμισης της έκφρασης γονιδίων που συμμετέχουν στον μεταβολισμό της HDL.Στην ενότητα IV μελετήσαμε τον μηχανισμό με τον οποίο ρυθμίζεται στο ήπαρ το γονίδιο του μεταγραφικού παράγοντα LXRα. Ο LXRα (Liver X Receptor α) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό των λιπιδίων και της χοληστερόλης, διότι ελέγχει άμεσα την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται σε αυτά τα μονοπάτια (για παράδειγμα των ABCA1, ABCG1, SREBP κλπ). Παρατηρήσαμε ότι ο υποκινητής του γονιδίου του LXRα του ανθρώπου (hLXRα) ενεργοποιείται από την δράση του HNF-4α, ο οποίος είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ και αποτελεί γενικό ρυθμιστή των γονίδιων που ενεργοποιούνται στο ήπαρ. Με πειράματα ChiP και DNAP εντοπίσαμε το σημείο πρόσδεσης του HNF-4α στον υποκινητή του LXRα στην περιοχή -50 με -40. Μετάλλαξη στο συγκεκριμένο μοτίβο πρόσδεσης οδήγησε σε απώλεια της ικανότητας του HNF-4α να ρυθμίζει θετικά την ενεργότητα του υποκινητή του LXRα. Αποσιώπηση του γονιδίου του HNF-4α οδήγησε σε μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης LXRα. Στην ενότητα V μελετήσαμε την ικανότητα του micro-RNA let-7b να ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου της απολιποπρωτεΐνης Ε (apoE) σε HepG2 κύτταρα. Η αποΕ παίζει σημαντικό ρόλο στην απομάκρυνση των υπολειμμάτων των λιποπρωτεϊνών από την κυκλοφορία αλλά και στην βιογένεση της HDL. Υπερέκφραση του let-7b προκάλεσε μείωση των επιπέδων τόσο του mRNA όσο και της πρωτεΐνης της apoE. Ωστόσο, η υπερέκφραση του let-7b δεν επηρέασε την ενεργότητα ενός πλασμιδίου που είχε κλωνοποιημένη την 3’-UTR περιοχή του mRNA της αποΕ υποδηλώνοντας ότι το let-7b δεν ρυθμίζει άμεσα, μέσω της 3’-UTR περιοχής, την έκφραση της apoE. Επιπρόσθετα, σε πειράματα όπου συνεκφράσαμε τον υποκινητή της apoE (-500/+73) με το let-7b είδαμε την ενεργότητα του υποκινητή να μειώνεται επιβεβαιώνοντας τον έμμεσο τρόπο ρύθμισης αυτού του γονιδίου από το let-7b. Παράλληλα, διαπιστώσαμε την ικανότητα του let-7b να ρυθμίζει την έκφραση και της αποΑ-Ι, η οποία είναι η κύρια πρωτεΐνη της HDL. Παρατηρήσαμε ότι υπερέκφραση του let-7b μείωσε τόσο το mRNA της αποΑ-Ι όσο και την ενεργότητα του υποκινητή (-1020/-24) της. Βιοπληροφορική ανάλυση στο mRNA της αποΑ-Ι δεν ανέδειξε κάποιο σημείο πρόσδεσης του let-7b προτείνοντας ότι η αποΑ-Ι, όπως και η αποΕ, ρυθμίζονται με διαφορετικό από τον κλασσικό τρόπο από το let-7b. Συμπερασματικά, τα ευρήματα της παρούσας διατριβής προσφέρουν νέα γνώση πάνω στους μηχανισμούς που ελέγχουν τα επίπεδα και την λειτουργικότητα της HDL. Τα γονίδια που βρέθηκαν στην παρούσα μελέτη να μεσολαβούν στις δράσεις της HDL στα ενδοθηλιακά και στα ηπατικά κύτταρα θα μπορούσαν να έχουν διαγνωστική και θεραπευτική αξία σε ασθενείς με χαμηλά επίπεδα HDL ή με μη-λειτουργική HDL όπως ασθενείς με Καρδιαγγειακά Νοσήματα ή χρόνια φλεγμονώδη νοσήματα.