Μελέτη της χωροχρονικής οργάνωσης των RabGTPασων στη ρυθμιζόμενη έκκριση στα ενδοθηλιακά κύτταρα

Abstract

Weibel Palade Bodies (WPBs) are elongated secretory organelles of endothelial cells that contain von Willebrand factor (vWF) and other cargo proteins that contribute to hemostatic plug formation, inflammation, angiogenesis, and tissue repair. Thus, WPB exocytosis plays important role in the pathophysiology of blood vessels. To accomplish secretion of their cargo molecules, WPBs undergo maturation, transport and fusion with the plasma membrane. Rab GTPases are crucial factors in controlling the specific targeting of vesicles to their destination organelles. In previous studies we identified 5 Rabs (Rab3a, 15, 27a, 33a and 37) specifically localized at the membrane of WPBs (WPB-Rabs). In this Thesis, in order to get insights into the possible role of the five WPB-Rabs in the mechanisms of formation, transport and exocytosis of WPBs, we aimed in studying their spatio-temporal organization at WPBs. In particular, we studied the order and timing of recruitment of these Rabs at WPBs, from the time they are generated at the Golgi, until they mature and fuse with the plasma membrane. We found that the above 5 Rabs are recruited to the membrane of WPBs at least 1 hour after these organelles are produced from the Golgi compartment. The first Rabs that appear at WPBs, almost at the same time, are Rab27a and Rab33a; Rab37 is recruited soon after them, followed by the sequential recruitment of Rab3a and Rab15. Based on FRAP experiments, where we studied the fluorescence recovery time of WPBs after photobleaching of these 5 GFP-Rabs, we found that the recycling rate of Rabs, between membrane and cytoplasm, follow the order Rab3a>Rab15Rab33>Rab37Rab27. This order is indicative of the relative (comparatively between these five Rabs) stability of the complexes formed by these Rabs on the membrane, as well as of the rate of GTP hydrolysis and of their solubilization towards the cytoplasm. Finally, since Rab27a is the first recruited Rab at WPBs and, based on previous studies, the most important for their maturation and secretion, we studied the possible role of Rab27a in the membrane recruitment of the other four Rabs, by employing siRNA-based silencing experiments. These experiments showed that lack of Rab27a from the newly formed WPBs reduces the time of recruitment of Rab3a, Rab15, and Rab37, while it augments the time required for the recruitment of Rab33a. All in all, the above data provide the first to date information on the spatial-temporal recruitment and dynamics of WPB-Rabs, thus contributing to the understanding of the possible role of these Rabs on WPB maturation and exocytosis.

Τα Weibel Palade Bodies (WPBs) είναι επιμηκυμένα εκκριτικά οργανίδια των ενδοθηλιακών κυττάρων που περιέχουν τον παράγοντα von Willebrand (vWF) και άλλες πρωτεΐνες που εμπλέκονται στο σχηματισμό αιμοστατικών θρόμβων, στη φλεγμονή, στην αγγειογένεση και στην αποκατάσταση των ιστών. Έτσι, η εξωκυττάρωση των WPBs διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθοφυσιολογία των αιμοφόρων αγγείων. Για να επιτύχουν την έκκριση των μορίων τους, τα WPBs, υφίστανται μια αργή διαδικασία ωρίμανσης, κατά την οποία μεταφέρονται στην περιφέρεια του κυττάρου και συντήκονται με την πλασματική μεμβράνη. Οι Rab GTPases είναι καθοριστικοί παράγοντες που ελέγχουν την εξειδικευμένη στόχευση των κυστιδίων στα οργανίδια προορισμού τους. Σε προηγούμενη μελέτη εντοπίσαμε 5 Rabs (Rab3a, 15, 27a, 33a και 37) ειδικά εντοπισμένες στη μεμβράνη των WPBs (WPB-Rabs). Στην παρούσα εργασία, προκειμένου να λάβουμε πληροφορίες για τον πιθανό ρόλο των πέντε WPB-Rabs στους μηχανισμούς δημιουργίας, μετακίνησης και έκκρισης των WPBs, θέσαμε ως στόχο την μελέτη της χωροχρονικής οργάνωσης των παραπάνω Rabs στα WPBs. Πιο συγκεκριμένα, μελετήσαμε τη σειρά και το χρόνο στρατολόγησης αυτών των Rabs στα WPBs, από τη στιγμή του σχηματισμού τους, μέχρι να ωριμάσουν και να συντηχθούν με την κυτταροπλασματική μεμβράνη. Βρήκαμε ότι οι παραπάνω 5 Rabs στρατολογούνται στη μεμβράνη των WPBs τουλάχιστον 1 ώρα μετά από την σύνθεσή τους από το Golgi. Οι πρώτες Rabs που εμφανίζονται στα WPBs, σχεδόν ταυτόχρονα, είναι η Rab27a και η Rab33a. Η Rab37 στρατολογείται σύντομα μετά από αυτές, και ακολουθεί η διαδοχική στρατολόγηση των Rab3a και Rab15. Μέσω πειραμάτων FRAP, όπου μελετήσαμε το χρόνο ανάκτησης φθορισμού των WPBs μετά από φωτοσκίαση των πέντε GFP-Rabs, διαπιστώσαμε ότι η ταχύτητα ανακύκλωσης των Rabs, μεταξύ μεμβράνης και κυτταροπλάσματος, ακολουθεί τη σειρά Rab3a>Rab15Rab33a>Rab37Rab27a. Η σειρά αυτή είναι ενδεικτική της σχετικής (συγκριτικά μεταξύ των πέντε Rabs) σταθερότητας των συμπλόκων που σχηματίζουν οι Rabs στην μεμβράνη, αλλά και της ταχύτητας υδρόλυσης του GTP και της διαλυτοποίησής τους προς το κυτταρόπλασμα. Τέλος, δεδομένου ότι η Rab27a είναι η πρώτη Rab που στρατολογείται στα WPBs και, με βάση τις μέχρι τώρα μελέτες, η πιο σημαντική για την ωρίμανση και έκκρισή τους, μελετήσαμε τον πιθανό ρόλο της Rab27a στην στρατολόγηση των υπολοίπων τεσσάρων, πραγματοποιώντας πειράματα αποσιώπησης με siRNAs. Τα πειράματα αυτά κατέδειξαν ότι η έλλειψη της Rab27a από τα νεοσυντιθέμενα WPBs μειώνει τον χρόνο στρατολόγησης των Rab3a, Rab15, και Rab37, ενώ αυξάνει τον χρόνο που απαιτείται για την στρατολόγηση της Rab33a. Συμπερασματικά, τα παραπάνω δεδομένα παρέχουν τις πρώτες μέχρι σήμερα πληροφορίες σχετικά με την χωροχρονική στρατολόγηση και δυναμική των WPB-Rabs, συμβάλλοντας έτσι στην κατανόηση του πιθανού ρόλου αυτών των Rabs στην ωρίμανση και την εξωκυττάρωση των WPBs.