Pitx2 transcription factor: expression in the Central Nervous System and role in the development of spinal interneurons

Abstract

Pitx2 is a paired-like homeodomain transcription factor, mutations in which have been associated with the pathogenesis of Axenfeld-Rieger syndrome, an autosomal dominant condition that affects the eyes, teeth, heart and the umbilicus of the patients. Extensive studies in the mouse show that Pitx2 plays an important role in the development of the aforementioned tissues and more. In the spinal cord, Pitx2 marks a small Dbx1-derived ventral interneuron population that is divided in a cholinergic (V0c) and a glutamatergic (V0g) subset. V0c neurons give rise to all C boutons, namely large, cholinergic synapses on spinal motor neurons. Genetic ablation of the cholinergic transmission through the C bouton synapse leads to task-dependent inability to increase muscle-specific output. In my thesis, the use of molecular genetics enabled us to probe the origin of the C bouton synapse in the cranial motor neurons and map Pitx2 neurons throughout the postnatal mouse brain, with an emphasis on the cholinergic ones that are putative sources of the cranial C boutons. We showed that all C boutons on brainstem motor nuclei are Pitx2 derived, contrary to a previous publication stating that cranial C boutons have a mixed Pitx2+ and Pitx2- origin. New Pitx2 populations, including a small cholinergic one in the mammillary area, were identified for the first time in the postnatal mouse brain. Apart from using Pitx2 as a neuronal marker, we delved into the study of the role of Pitx2 protein on the development of spinal Pitx2 interneurons and discovered important parallelisms with known functions of Pitx2 in the subthalamic nucleus and the superior colliculus. For this study two Pitx2 knockout mouse models were studied: an embryonic lethal Pitx2 null and a conditional knockout in which Pitx2 expression is perturbed in Dbx1-derived neurons. In both models the homeodomain was eliminated leading to the generation of a truncated and non-functional Pitx2 peptide, which we were able to detect with immunofluorescence or in situ hybridization, thus visualizing the Pitx2 deficient neurons. The most prominent observation, common in both models, is that Pitx2 is required for the correct localization of the spinal Pitx2 interneurons, indicating a role for Pitx2 in the migration process. Moreover, loss of Pitx2 results in lack of cholinergic specification of the V0c subset and therefore in absence of the C boutons from the spinal motor neuron somata. Whether these effects can be attributed to Pitx2 loss directly, if Pitx2 is upstream of genes that regulate the cholinergic character or these effects are secondary to the mislocalization of Pitx2 deficient neurons and arise due to loss of correct positional cues is a matter that will need further examination. Pitx2 loss seems to affect the number of Pitx2 deficient neuron, as well. The results of this study with dual focus on the anatomy and connectivity of brain and brainstem Pitx2 circuitry and on the role of Pitx2 transcription factor in the spinal Pitx2 interneuron development contribute to the endeavor of bridging molecular identity with the charting and function of neural circuits, as a basis for the comprehension of physiology and pathology of the Central Nervous System.

Η πρωτεΐνη Pitx2 ανήκει στην ομάδα των μεταγραφικών παραγόντων που φέρουν ομοιοεπικράτεια (homeodomain) και οι οποίοι είναι γνωστοί για τη συμμετοχή τους σε σημαντικές αναπτυξιακές λειτουργίες, όπως η νευρογένεση και η δημιουργία προτύπου σώματος. Μεταλλάξεις στο γονίδιο της Pitx2 στον άνθρωπο εμπλέκονται στην εμφάνιση ενός αυτοσωμικού επικρατούς συνδρόμου, του συνδρόμου Axenfeld-Rieger, που επηρεάζει πολλαπλά όργανα, με προεξάρχοντες τους οφθαλμούς, τους οδόντες, την καρδιά και τον ομφαλό. Η βασική έρευνα επίσης υποδεικνύει ότι η πρωτεΐνη Pitx2 παίζει κομβικό ρόλο στην ανάπτυξη των αντίστοιχων οργάνων. Στο νωτιαίο μυελό η Pitx2 εκφράζεται σε ένα μικρό υποσύνολο των V0 διάμεσων νευρώνων που συνολικά προέρχονται από Dbx1+ προγονικούς νευρώνες. Αυτή η ομάδα των Pitx2+ νευρώνων διαχωρίζεται περαιτέρω σε δύο ίσες περίπου σε αριθμό νευρώνων υποομάδες, μια χολινεργική (V0c) και μια γλουταματεργική (V0g). Οι χολινεργικοί Pitx2 νευρώνες δημιουργούν μεγάλες, χολινεργικές συνάψεις στη μεμβράνη του σώματος και των κοντινών στο σώμα δενδριτών των κινητικών νευρώνων. Οι συνάψεις αυτές έχουν ονομαστεί C boutons και η προέλευσή τους παρέμενε άγνωστη μέχρι την ανακάλυψη των Pitx2 χολινεργικών διάμεσων νευρώνων. Διακοπή της χολινεργικής νευροδιαβίβασης μέσω των C boutons οδηγεί σε αδυναμία αύξησης του έργου συγκεκριμένων μυών του ποντικού σε απαιτητικές δοκιμές, όπως η κολύμβηση.Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι ο εντοπισμός της προέλευσης των C boutons που βρίσκονται στους κινητικούς νευρώνες του εγκεφαλικού στελέχους και η ανίχνευση Pitx2 νευρώνων στον εγκέφαλο ποντικών μετά τη γέννηση. Δείξαμε ότι και τα C boutons του στελέχους προέρχονται από Pitx2 νευρώνες κατ’ αναλογία με τους κινητικούς νευρώνες του νωτιαίου μυελού. Αυτό το αποτέλεσμα έρχεται σε αντίθεση με προηγούμενη δημοσίευση, που παρουσίαζε ότι τα C boutons του στελέχους προέρχονται από νευρώνες που εκφράζουν Pitx2 και από νευρώνες που δεν εκφράζουν. Πιστεύουμε ότι οι μοριακές τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διδακτορική εργασία είναι καταλληλότερες για την απάντηση αυτού του ερωτήματος. Επιπλέον, κατά την ανάλυση των περιοχών του εγκεφάλου στις οποίες εντοπίζονται Pitx2 νευρώνες, επιβεβαιώσαμε την ύπαρξη τους σε περιοχές που έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία του εμβρυικού και νεογνικού εγκεφάλου του ποντικού, αλλά εντοπίσαμε και πληθυσμούς Pitx2 νευρώνων σε νέες θέσεις. Ένας από αυτούς τους πληθυσμούς είναι ο χολινεργικός Pitx2 πληθυσμός των μαστίων (mammillary area) του υποθαλάμου, ο οποίος μαζί με το χολινεργικό Pitx2 πληθυσμό του νωτιαίου μυελού και του στελέχους, αποτελούν τους μόνους χολινεργικούς Pitx2 πληθυσμούς του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος και επομένως πιθανούς νευρώνες προέλευσης των C boutons του στελέχους.Δεύτερος στόχος της εργασίας αποτέλεσε η διερεύνηση του ρόλου του μεταγραφικού παράγοντα Pitx2 στην ανάπτυξη των νευρώνων του νωτιαίου μυελού. Κατά την μελέτη αυτή διαπιστώθηκαν αρκετοί παραλληλισμοί σε σχέση με το ρόλο του Pitx2 στην ανάπτυξη των Pitx2 νευρώνων του νωτιαίου μυελού και των Pitx2 νευρώνων του υποθαλαμικού πυρήνα (subthalamic nucleus) και του άνω διδυμίου (superior colliculus), όπως αυτοί έχουν περιγραφεί στη βιβλιογραφία. Χρησιμοποιήθηκαν δύο knock out μοντέλα ποντικών: στο πρώτο έλειπε η Pitx2 από όλο το σώμα του ποντικού (Pitx2 null) και παρουσίαζε εμβρυική θνητότητα και στο δεύτερο δεν εκφραζόταν Pitx2 στους νευρώνες που προέρχονται από Dbx1 προγονικούς νευρώνες (Pitx2 conditional knockout), όπως στους Pitx2 νευρώνες του νωτιαίου μυελού. Και στα δύο μοντέλα λείπει η ομοιοεπικράτεια και συντίθεται μόνο ένα μη ολοκληρωμένο και μη λειτουργικό Pitx2 πεπτίδιο, η ανίχνευση του οποίου με ανοσοφθορισμό ή in situ υβριδοποίηση οδηγεί στον εντοπισμό των νευρώνων που θα εξέφραζαν φυσιολογικά Pitx2 (ελλειμματικοί Pitx2 νευρώνες).Η πιο σημαντική παρατήρηση που προέκυψε από τη μελέτη των δύο μοντέλων έλλειψης Pitx2 είναι ότι η παρουσία της Pitx2 είναι απαραίτητη για την απόκτηση της σωστής θέσης στο χώρο, υποδεικνύοντας πιθανό ρόλο της στην μετανάστευση των Pitx2 νευρώνων του νωτιαίου μυελού κατά την ανάπτυξή τους. Επιπλέον, η έλλειψη Pitx2 οδηγεί σε απώλεια του χολινεργικού χαρακτήρα των V0c νευρώνων και κατ’ επέκταση στη μη δημιουργία C boutons στους κινητικούς νευρώνες του νωτιαίου μυελού. Εάν η απώλεια έκφρασης χολινεργικών δεικτών είναι απόρροια της έλλειψης Pitx2 ή συμβαίνει δευτερογενώς, λόγω της μη ορθής θέσης των ελλειμματικών Pitx2 νευρώνων και της προκύπτουσας απώλειας χωροταξικών πληροφοριών (positional cues), είναι ένα ερώτημα που βρίσκεται ακόμα υπό διερεύνηση. Η έλλειψη της Pitx2 επηρεάζει και τον αριθμό των ελλειμματικών Pitx2 νευρώνων με τρόπο που εξαρτάται από την ηλικία που εξετάζεται.Τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας, που εστιάζει στη μελέτη της ανατομίας και της συνδεσιμότητας του κυκλώματος των Pitx2 νευρώνων και στο ρόλο της πρωτεΐνης Pitx2 στην ανάπτυξη διάμεσων νευρώνων του νωτιαίου μυελού, συνεισφέρουν στη διασύνδεση της μοριακής ταυτότητας με τη χαρτογράφηση και τη λειτουργία των νευρωνικών κυκλωμάτων δημιουργώντας μία βάση για την κατανόησης της φυσιολογίας και της παθολογίας του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος.