Μηχανισμοί ελέγχου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης των νεοπλασματικών κυττάρων σε αιματολογικές κακοήθειες

Abstract

Deregulation of intracellular signaling events controlling proliferation and apoptosispromotes neoplastic aberration. Chronic lymphocytic leukemia (CLL), a malignancyof lymphoid cells, constitutes a model disease for the study of disorders of cell cycleand apoptosis. CLL is a clinically heterogeneous disease despite the homogenousphenotype of patients at diagnosis.Mounting evidence suggests that the development and evolution of CLL aredependent upon stimuli originating from the microenvironment. A critical role isplayed by antigenic stimulation through the B cell receptor (BcR). The BcR comprises2 types of components: the recognition unit constituted by a membraneimmunoglobulin (IG), and the signal transmission unit comprising the coreceptorsCD79a and CD79b. Developing normal B cells generate a vast repertoire of antibodyspecificities through somatic recombination of distinct variable (V), diversity (D)(heavy chain only), and joining (J) genes to form the variable domain exons of IG.Rearrangement of IGHV-IGHD-IGHJ genes encodes for the variable domain of IG andfollowed by rearrangement with constant region IGHM gene. At the next steplymphocytes rearrange light chains. At the end of this procedure the lymphocytesexpress IGM in their surface. Lymphocytes activated upon antigen encounter, arefurther diversified by introduction of somatic hypermutation. Somatichypermutation (SHM) of IG variable genes forms a second round of diversificationwhich increases antibody specificity.Antigenic stimulation through the BcR seems to play a critical role at the evolution of CLL. In recent years, the mutational status of IGHV genes has been established asone of the most important molecular genetic markers in defining prognosticsubgroups of chronic lymphocytic leukemia (CLL). The 98% homology to the closestgermline IGHV gene was firstly chosen as a shortcut to exclude potentialpolymorphic variants and has been used by the majority of studies to make theclinically relevant distinction between “mutated” and “unmutated” CLL cases.Recent studies revealed that CLL cells may also interact with their microenvironmentvia receptors of both adaptive (B-cell receptor, BcR) and innate immunity (e.g. Tolllikereceptors, TLRs) and that this interaction plays a prominent role in CLL development and evolution. Synergism between innate and adaptive immunity is awell-known phenomenon in both normal and autoreactive lymphocytes. Emergingdata from concomitant BcR/TLR stimulation in CLL are limited since most studieshave examined the effects of immune stimulation only after single BcR or TLRtriggering.On these grounds, we here investigated (i) the molecular features of the BcR in CLLand possible correlations with the aggressiveness of the disease and (ii) the impactof in vitro single (BcR, TLR7 and TLR9) or concomitant (BcR/TLR7 και BcR/TLR9)stimulation on the proliferation and apoptosis of CLL cells.We examined productive IGHV-IGHD-IGHJ rearrangements from 799 CLL cases,focusing on IGH gene repertoire, mutational status and somatic mutationcharacteristics of the IGHV genes. Initially, following the 98% identity cutoff valuewith the closest germ line IGHV gene, sequences were subdivided into unmutated(U) and mutated (M) categories. Sequences were further subdivided in subgroupswith 1% difference identity with germ line genes and survival curves for subgroups ofpatients with varying degrees of sequence identity were prepared. In keeping withprevious studies, the IGHV gene repertoire was remarkably biased. In addition, SHManalysis, performed for all CLL sequences in this cohort with less than 100% identityto germ line, showed that SHM patterns were typical of a canonical SHM process.Furthermore, the 98% sequence identity cut off value, although arbitrary, has themost prognostic value. To explore whether specific types of BcR/TLR collaboration exist in CLL, we studied the effect of single vs. concomitant BcR and/or TLR stimulation on CLL cells from 11M-CLL and 10 U-CLL cases stimulated with anti-IgM, Imiquimod and CpG ODN forBcR, TLR7 and TLR9 respectively, alone or in combination. Results were estimated bydetermining pERK levels while the induction of apoptosis determining the activeisoform of caspase 8 and the cleaved fragment of PARP. Pronounced pERK inductionwas seen by single stimulation in U-CLL, whereas BcR/TLR synergism was required inM-CLL. An opposite pattern was observed regarding induction of apoptosis, with MCLLresponding even to single stimulation, contrasting U-CLL that showed minimalresponse. Differential responses of CLL cells depending on the mutational status of the BcR, probably indicates different operating result, ultimately reflected in the behavior of the leukemic clone and modifies the rate of cell proliferation and apoptosis.

H νεοπλασματική εκτροπή είναι το αποτέλεσμα της διαταραχής των ρυθμιστικών μηχανισμών που διέπουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση.Μεταξύ των κακοηθειών του αιμοποιητικού ιστού, η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ) θεωρείται νόσος-υπόδειγμα για τη μελέτη του ρόλου των διαταραχών του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης στη νεοπλασματική εκτροπή και χαρακτηρίζεται από μεγάλη κλινική ετερογένεια παρά τον ομοιογενή κλινικό και εργαστηριακό φαινότυπο των ασθενών κατά τη διάγνωση. Πολλά δεδομένα υποδεικνύουν πως το μικροπεριβάλλον διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη της ΧΛΛ. Κεντρικό ρόλο στη λευχαιμογένεση διαδραματίζει ο Β κυτταρικός υποδοχέας (B cell receptor, BcR). ΟBcR ρυθμίζει όλες σχεδόν τις λειτουργίες των φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων, συναρμολογείται από την επιφανειακή ανοσοσφαιρίνη IgΗ και τις διαμεμβρανικές πρωτεΐνες Igα (CD79a) και Igβ (CD79b). Η επιφανειακή ανοσοσφαιρίνη κωδικοποιείται αρχικά από τα γονίδια IGHV, IGHD και IGHJ της μεταβλητής περιοχής των βαριών αλυσίδων που αναδιατάσσονται με ιεραρχικό τρόπο κατά την ωρίμανση των Β λεμφοκυττάρων. Η αναδιάταξη των ανασυνδυασμένων γονιδίωνIGHV-IGHD-IGHJ με τη σταθερή περιοχή τη ΙGHM ακολουθείται από την αναδιάταξη των ελαφριών αλυσίδων και καταλήγει στην έκφραση της ανοσοσφαιρίνης IgM στην επιφάνεια των Β λεμφοκυττάρων. Η αναγνώριση και η πρόσδεση του αντιγόνου στη μεταβλητή περιοχή της ανοσοσφαιρίνης ενεργοποιεί τα Β λεμφοκύτταρα που διαφοροποιούνται στα βλαστικά κέντρα μέσω της σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης (ΣΥΜ). Το τελικό αποτέλεσμα της ΣΥΜ είναι η εισαγωγή μεταλλάξεων στην μεταβλητή περιοχή των ανοσοσφαιρινών και η δημιουργία ανοσοσφαιρινών με υψηλότερη συγγένεια για το αντιγόνο.Η αντιγονική διέγερση μέσω του BcR διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη της ΧΛΛ. Τo φορτίο των σωματικών μεταλλάξεων των γονιδίων IGHVαποτελεί σήμερα τον πιο σημαντικό προγνωστικό παράγοντα στους ασθενείς με ΧΛΛ. Tο ποσοστό νουκλεοτιδικής ταυτότητας 98% του αναδιαταγμένου γονιδίουIGHV του νεοπλασματικού κλώνου με το αντίστοιχο μη αναδιαταγμένο γονίδιο IGHV χρησιμοποιείται ευρέως για την κατάταξη των αναδιατάξεων στη ΧΛΛ σε μεταλλαγμένες και αμετάλλακτες. To όριο ομολογίας 98% αν και δεν έχει βιολογική σημασία, επιλέχθηκε αρχικά ώστε ν’ αποφευχθεί το ενδεχόμενο κάποιες από τις διαφορές ν’ αντιστοιχούν σε άγνωστους πολυμορφισμούς του γενετικού τόπου IGH.Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η αλληλεπίδραση των νεοπλασματικών λεμφοκυττάρων με το μικροπεριβάλλον μέσω του Β κυτταρικού υποδοχέα (BcR)αλλά και των υποδοχέων της έμφυτης ανοσίας (TLRs) παίζει σημαντικό ρόλο στη νεοπλασματική εκτροπή. Η συνεργασία προσαρμοστικής και έμφυτης ανοσίας αποτελεί ιδιότητα των φυσιολογικών αλλά και των αυτοαντιδραστικών λεμφοκυττάρων. Τα δεδομένα από τη συνδιέγερση BcR/TLR στη ΧΛΛ είναι πολύ περιορισμένα επειδή οι περισσότερες μελέτες αφορούν μεμονωμένη in vitroδιέγερση είτε του BcR είτε των TLRs.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν: (i) τα ιδιαίτερα μοριακά χαρακτηριστικά του BcR στη ΧΛΛ και διερευνήθηκε πιθανή συσχέτισή τους με την κλινική επιθετικότητα της νόσου, και (ii) ο αντίκτυπος της in vitro διέγερσης του BcR,των TLR7 και TLR9 μεμονωμένα ή σε συνδυασμό (BcR/TLR7 και BcR/TLR9) στην επιβίωση και την απόπτωση των νεοπλασματικών κυττάρων της ΧΛΛ. Αρχικά αναλύθηκαν οι κλωνικές αναδιατάξεις των γονιδίων IGHV-IGHD-IGHJ σε 799 ασθενείς με ΧΛΛ. Μελετήθηκε το ρεπερτόριο και το φορτίο των μεταλλάξεων των γονιδίων IGH, καθώς και τα μοριακά χαρακτηριστικά των μεταλλάξεων. Οι αναδιατάξεις IGHV-IGHD-IGHJ αρχικά διακρίθηκαν σε αμετάλλακτες (Α) και μεταλλαγμένες (Μ) με βάση το γενικά αποδεκτό όριο ομολογίας 98% του γονιδίουIGHV σε σχέση με το αντίστοιχο μη αναδιαταγμένο γονίδιο ΙGHV. Στη συνέχεια, οι αναδιατάξεις διακρίθηκαν περαιτέρω σε διαδοχικά υποσύνολα που διέφεραν μεταξύ τους κατά 1% ως προς την νουκλεοτιδική ταυτότητά τους με το αντίστοιχομη αναδιαταγμένο γονίδιο IGHV και διερευνήθηκε η πιθανή προγνωστική αξία αυτών των υποσυνόλων στο χρόνο έναρξης θεραπείας και την ολική επιβίωση των ασθενών. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης επιβεβαίωσαν προηγούμενες μελέτες αναφορικά με την επιλεκτικότητα του ρεπερτορίου και έδειξαν ότι η εισαγωγή των μεταλλάξεων σε όλες τις υποομάδες με ομολογία <100%πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του κλασσικού μηχανισμού σωματικής υπερμεταλλαξιγένεσης. Επιπλέον, έδειξαν ότι το όριο 98% υπερτερεί ως προς την προγνωστική σημασία για τους ασθενείς με ΧΛΛ. Στη συνέχεια μελετήθηκαν τα αποτελέσματα της in vitro διέγερσης των BcR, TLR7και TLR9 με αντι-IgM, Imiquimod και CpG, αντιστοίχως, μεμονωμένα ή σε συνδυασμό, σε 21 ασθενείς με ΧΛΛ (11 Μ-ΧΛΛ, 10 Α-ΧΛΛ). Τα αποτελέσματα της διέγερσης εκτιμήθηκαν με προσδιορισμό της pERK, ενώ η επαγωγή της απόπτωσης με προσδιορισμό της κασπάσης 8 και της PARP. Αυξημένα επίπεδα pΕRΚ παρατηρήθηκαν μετά από μεμονωμένη διέγερση των BcR, TLR7 και TLR9 στην ΑΧΛΛ,ενώ στη Μ-ΧΛΛ μόνο με συνδιέγερση BcR/TLR. Αντίθετα, η μεμονωμένη διέγερση των TLR7 και TLR9 αλλά και η συνδιέγερση BcR/TLR βρέθηκαν να προκαλούν επαγωγή της απόπτωσης κυρίως στη M-ΧΛΛ. Η διαφορετική ανταπόκριση των νεοπλασματικών λεμφοκυττάρων στη Μ-ΧΛΛ έναντι της Α-ΧΛΛ πιθανότατα υποδεικνύει διαφορετικό λειτουργικό αποτέλεσμα, που αντικατοπτρίζεται τελικά στη συμπεριφορά του λευχαιμικού κλώνου και τροποποιεί το ρυθμό κυτταρικού πολλαπλασιασμού και την απόπτωση.