Identification of novel molecules implicated in the pathogenesis and monitoring of lupus nephritis using microarrays: a clinical and laboratory study

Abstract

Systemic lupus erythematosus (SLE) is a challenging autoimmune disease with manifestationsderived from the involvement of multiple organs including the kidneys, the joints, the nervoussystem as well as hematopoietic organs. Lupus nephritis (LN) is one of the most severemanifestations of SLE and a major risk factor for morbidity and mortality. The frequency isparticularly high in juvenile-onset SLE and in patients of African ancestry. Ten percent ofpatients with LN will develop end stage renal disease (ESRD). The main pathological featurein LN is immune complex formation and deposition in the kidney, which results inintraglomerular inflammation with recruitment of leucocytes and activation and proliferationof resident renal cells. Gene expression studies in LN have revealed gene networks that involve not only immune cell infiltration but also extracellular matrix formation and renal tissue repair and fibrosis.Micro-RNAs (miRNAs) come from a large family of small non-coding RNA sequences, whichare about 22 nucleotides in length. They constitute critical posttranscriptional regulators ofgene expression and act either as translational inhibitors of gene expression or by degradingmRNA transcripts since they bind to complementary sequences in the 3’ untranslated region(3’UTR) of target mRNAs. Multiple studies have shown that a cluster of key miRs are highlyexpressed in the kidney and play a critical role in renal development and function. They alsoaffect the diabetic or polycystic kidney, the kidney with IgA, acute injury or renal cellcarcinoma.The role of miRNAs as transcriptional modulators in the pathogenesis of SLE has recentlyemerged and their regulatory effects on DNA methylation pathway, type I IFN pathway,estrogen and regulatory T-cells are becoming clear. MiRNA expression has been studied inperipheral blood mononuclear cells (PBMCs), CD4 T cells, kidney biopsy tissue and EpsteinBarr virus transformed B-cell lines from patients with SLE.In this study, we investigated the role of miRNAs in human LN. To this end, we analysed themiRNA profile in kidney biopsy samples of patients with LN by TaqMan based array aimingto identify novel genes involved in disease pathogenesis. We identified important miRNAgene pairs and constructed gene networks that are potentially involved in LN pathogenesis.We focused on miR-422a, which is the most upregulated miRNA that correlates with active5histological lesions and its target Kallikrein-4 (KLK-4), a serine esterase with putativerenoprotective properties.Compared to normal tissue a 24-miRNA signature defines human LN with 9 miRNAs upregulated and 15 miRNAs down-regulated, and miR-422a exhibits the highest up-regulation(17.2-fold). These mi-RNAs with altered expression are predicted to target genes involved ininflammatory signaling pathways, membrane transporters and cell homeostasis such as TGF-β, protein kinase A, ERK/MAPK, NF-κB, HNF4A, Wnt/β-catenin signaling. Bioinformaticanalysis predicted that miR-422a has a binding site in the 3’UTR of KLK4 gene, a member ofthe kallikrein family of serine proteases. This was validated by overexpression of miR-422a,which suppressed by 65% KLK4 luciferase activity and by 82% KLK4 mRNA levels inHuman embryonic kidney - 293 cells (HEK-293).In order to monitor miR-422a/KLK4 expression during LN progression, we used NZB/W F1lupus mice. We found that at early stages miR-422a was 4.1-fold up-regulated, while KLK4mRNA levels were 3.4-fold down-regulated while at later stages miR-422a was 9.4-fold upregulated and KLK4 mRNA levels were 7.6-fold down-regulated. In unaffected NZW kidneyand human control specimens, KLK4 protein was strongly expressed, mainly in the cytoplasmof renal tubular as well as mesangial cells. In contrast, KLK4 showed absent or faint ormoderate expression in renal parenchymal cells of proteinuric NZB/W F1 and most patientswith active LN. Together, these data implicate miRNAs and KLK4, a secreted serine esterasewith angiogenic and extracellular matrix remodeling properties, in the pathogenesis ofimmune-mediated LN.

Ο Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος (ΣΕΛ) αποτελεί ένα συστηματικό νόσημα αυτοάνοσης αιτιολογίας με προσβολή πολλών οργάνων όπως οι νεφροί, οι αρθρώσεις, το νευρικό σύστημα και τα αιμοποιητικά όργανα. Η νεφρίτιδα του λύκου αποτελεί από τις πιο σοβαρές εκδηλώσεις της νόσου με σημαντικά ποσοστά νοσηρότητας και θνητότητας.Εμφανίζεται κυρίως σε νεαρές ηλικίες και σε ασθενείς Αφρικανικής καταγωγής. Δέκα τοις εκατό των ασθενών θα εμφανίσουν νεφρική νόσο τελικού σταδίου. Τα κύρια ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά της νόσου αφορούν την εναπόθεση ανοσοσυμπλεγμάτων στο σπείραμα, που οδηγεί σε φλεγμονή με ενεργοποίηση λευκοκυττάρων και κυττάρων του σπειράματος.Γονιδιακές μελέτες έχουν αποκαλύψει δίκτυα που εμπλέκουν τόσο το ανοσοποιητικό σύστημα όσο και τη δημιουργία εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και τη συμμετοχή των «τοπικών»κυττάρων στη παθογένεια της νόσου.Τα miRNAs αποτελούν μια νέα ομάδα εξελικτικά καλά διατηρημένων μικρών μορίων RΝΑ που δεν κωδικοποιούν για πρωτεΐνες και έχουν μήκος 22 νουκλεοτιδίων. Θεωρούνται σημαντικοί αρνητικοί ρυθμιστές της έκφρασης γονιδίων σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο.Ανάλογα με τον βαθμό συμπληρωματικότητας, τα miRNAs προσδένονται στα mRNAs-στόχους τους και είτε προκαλούν την αποικοδόμηση τους, είτε αναστέλλουν την μετάφραση τους σε πρωτεϊνικά μόρια. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι εκφράζονται στο νεφρό και εμπλέκονται τόσο στην ανάπτυξη και τη φυσιολογική λειτουργία του, όσο και σε παθολογικές καταστάσεις όπως η διαβητική νεφροπάθεια, η πολυκυστική νόσος, η IgA νεφροπάθεια, η οξεία νεφρική βλάβη ή οι κακοήθεις όγκοι του νεφρού.Ο ρόλος των miRNAs ως μεταγραφικοί ρυθμιστές στη παθογένειά του ΣΕΛ έχει μελετηθεί εκτενώς και έχει βρεθεί ότι εμπλέκονται σε μονοπάτια μεθυλίωσης του DNA, IFN-I,οιστρογόνων και ρυθμιστικών Τ-λεμφοκυττάρων. Η έκφραση τους έχει επίσης μελετηθεί σε μονοκύτταρα περιφερικού αίματος, CD4 T-λεμφοκυττάρων, βιοψίες νεφρού καθώς και Β-κυτταρικές σειρές επιμολυσμένες με EBV.Με στόχο την ανεύρεση νέων γονιδίων που συμβάλλουν στην νεφρίτιδα στο ΣΕΛ, στην παρούσα εργασία μελετούμε την έκφραση και λειτουργία των miRNAs στο νεφρικό ιστό ασθενών με νεφρίτιδα του ΣΕΛ με την χρήση της τεχνολογίας των μικροσυστοιχείων(microarrays). Ταυτοποιήσαμε έναν αριθμό miRNAs – γονιδίων στόχων με διαφορετική έκφραση και κατασκευάσαμε δίκτυα γονιδίων που πιθανόν εμπλέκονται στη παθογένεια τη νόσου. Το miR-422a βρέθηκε να έχει τη μεγαλύτερη έκφραση, να συσχετίζεται με ενεργείς ιστολογικές βλάβες στο σπείραμα και να ελέγχει την έκφραση της Καλλικρεϊνης 4 (KLK-4),μίας σερίνης εστεράσης με πιθανή προστατευτική δράση στο νεφρό. Σε σύγκριση με τον υγιή ιστό, στους νεφρούς των ασθενών με νεφρίτιδα ΣΕΛ παρατηρήθηκε μεταβολή της έκφρασης σε 24 miRNAs (αυξημένη έκφραση σε 9, μειωμένη έκφραση σε 15miRNAs). Το miR-422a παρουσίασε τη μεγαλύτερη αύξηση (17.2 φορές). Τα προβλεπόμενα γονίδια – στόχοι εμπλέκονται σε σηματοδοτικά μονοπάτια φλεγμονής, μεταφορέων μεμβράνης , κυτταρικής ομοιόστασης όπως TGF-β, protein kinase A, ERK/MAPK, NF-κB,HNF4A, Wnt/β-catenin. Η βιοπληροφορική ανάλυση έδειξε ότι το miR-422a συνδέεται στην 3’UTR περιοχή του γονιδίου της KLK4 και καταστέλλει την έκφρασή της. Σε πειράματα διαμόλυνσης των κυττάρων HEK293, η υπερέκφραση του miR-422a κατέστειλε κατά 65% τη λουσιφεράση του γονιδίου της KLK4 και κατά 82% τα επίπεδα του mRNA της.Μελετήθηκε η έκφραση των miR-422a/KLK4 κατά την εξέλιξη της νεφρίτιδας του λύκου σε ποντίκια NZB/W F1. Στα πρώιμα στάδια νεφρίτιδας ΣΕΛ (ποντικοί ΝΖΒx NZW F1 ηλικίας2 μηνών) παρατηρήθηκε αύξηση του miR-422a κατά 4.1 φορές και μείωση του KLK4 mRNAκατά 3.4 φορές. Οι παραπάνω μεταβολές ενισχύθηκαν σε προχωρημένο στάδιο της νόσου(ποντικοί ηλικίας 6 μηνών) με αύξηση του miR-422a κατά 9.4 φορές και μείωση του KLK4mRNA κατά 7.6 φορές σε σύγκριση με νεφρικό ιστό από υγιείς ποντικούς. Σε υγιείς μάρτυρες(ανθρώπινο ή δείγμα από ποντίκι) η KLK4 εκφραζόταν στο κυτταρόπλασμα τόσο των σωληναριακών όσο και των μεσαγγειακών κυττάρων. Αντιθέτως, δεν παρατηρήθηκε έκφραση της στα παρεγχυματικά κύτταρα NZB/W F1 ή ασθενών με πρωτεΐνουρία. Συνολικά, τα παραπάνω δεδομένα αναδεικνύουν το πιθανό ρόλο των miRNAs και της KLK4 στη παθογένεια της νεφρίτιδας του λύκου.