Ο ρόλος των αγγειογενών και αγγειοστατικών C-X-C χημειοκινών στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου

Abstract

Colorectal cancer is the second leading etiology of cancer death in Western countries as almost half of the patients die of metastatic disease after curative surgery despite adjunct chemotherapy. In the development and the metastasis of the tumor CXC chemokines are possibly the proteins with the most devastating influence upon these procedures. Following this statement the main goal of our study was to quantify the amount of 3 angiodrastic of these chemokines and one pro-angiogenic cytokine produced by cancer tissue compared to normal mucosa from the same patient. In addition we studied the same chemokine production by two well characterized colon adenocarcinoma cell lines.The CXC chemokines we chose to study belong to the CXC family and two of them, CXCL8 and CXCL6, bear the ELR aminocid motif, the presence of which is considered to confer pro-tumoral and angiogenic properties. The third CXC chemokine, CXCL4, without this ELR motif is believed to be angiostatic, although its role in the development of the tumor appears quite controversial in many studies.The measurement of the quantity of these 4 angiodrastic cytokines was done in two separate tissue samples from cancer and normal tissue obtained from the same patient. Results were expressed as pg chemokine / ng tissue protein. In addition to these angiodrastic cytokines several other clinicopathological factors (Ki67, p53, p21, bcl2, EGFR and MLH1) were semi-quantified and the possible association of these parameters with chemokine levels was investigated. Moreover the colon cancer cell lines, HT-29 and Caco2 were cultured for 24 hours in the presence of human serum, either from cancer patients or from healthy individuals. The effect of addition to the incubation medium Fetal Bovine Serum (FBS) was also investigated.Tissue chemokines were detected by Western-Blot Analysis and quantified by ELISA. The clinicopathological indeces were detected and semi-quantified Immunohistochemically. The results were statistically analyzed by the Wilcoxon test.Culture supernatants from five different culture experiments were studied. Cells were incubated with serum (human from five cancer patients and five healthy individuals and FBS. As controls incubations with only culture medium (McCoys for HT-29 and MEM for Caco2) were run so as their basal chemokine production could be identified. All cultures were run on six-well culture plates for 24 hours and the time points at which we measured the chemokine production were : 2, 4, 6, 12 and 24 hours. The quantification of chemokines in the supernatants was done by ELISA and statistical analysis was done using the one-way ANOVA and General Linear Model for repeated measures tests.There was a significant increase of CXCL6 (p=0.005) and VEGF (p=0.003) in cancerous tissue compared to normal. Patients with lower levels of CXCL4 and CXCL8 appeared to live significantly longer. Moreover patients with loss of EGFR expression showed higher levels of CXCL8 while p21 loss was associated with increased levels of CXCL6. Chemokine levels were not correlated with TNM or Duke’s classification. A strong p53 expression was accompanied by decreased survival.In the culture studies of HT-29 and Caco2 cell lines we demonstrated that colonic epithelial cells are potent producers of angiodrastic chemokines.HT29 and Caco2 cells produce all four chemokines under basal conditions and over 24 hours after incubation with human serum or FBS. However the production is not uniform for all chemokines .The secretion response of these two cell lines is completely different. HT29 produce more IL-8 and VEGF irrespective of serum incubation while Caco2 cells are relatively unresponsive. The opposite is true for CXCL6 and CXCL4. Moreover HT29 cells produce more IL-8 and VEGF over 24 hours when incubated with cancer serum. On the other hand Caco2 cells produce more CXCL4 when incubated with cancer serum.Conclusions1)The angiogenic factors CXCL6 and VEGF are increased in colorectal cancer tissue with no association with the clinical stage of the disease or survival.2)However increased levels of tissue CXCL8 and CXCL4 are associated with poor survival.3)Strong expression of p53 is found in patients with poor survival.4)Culture studies imply that cancer cells are producers of all four cytokines studied but the response of the two cell lines is different. CXCL8 and VEGF seem to be similarly regulated in a different way than CXCL4 and CXCL6.5)Inclusion of Fetal Bovine Serum in the incubation medium strongly influences the results.

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η δεύτερη συχνότερη αιτία θανάτου, μεταξύ των προκαλούμενων καρκινικών θανάτων στις Δυτικές χώρες. Περισσότεροι από τους μισούς θανάτους προκαλούνται από μεταστάσεις του που έχουν αναπτυχθεί μετά την χειρουργική αφαίρεση του όγκου παρά την εφαρμογή επιπλέον χημειοθεραπείας. Στην ανάπτυξη, και την μετάσταση του αρχικού όγκου οι CXC χημειοκίνες είναι ίσως τα μόρια με την μεγαλύτερη σημασία στην εξέλιξη καθώς συμμετέχουν σ όλα τα στάδια του όγκου, από την ανοσοκαταστολή και την αγγειογένεση έως τον πολλαπλασιασμό και την μετάστασή τους. Στο πλαίσιο αυτή της γνώσης σκοπός της μελέτης μας ήταν η ποσοτικοποίηση της έκφρασης 3 αγγειοδραστικών χημειοκινών και μίας αγγειογενούς κυτταροκίνης σε καρκινικά και υγιή κύτταρα καθώς και σε 2 καρκινικές εντερικές κυτταρικές σειρές.Οι 3 χημειοκίνες που επιλέξαμε να μελετήσουμε ανήκουν όλες στην ομάδα των CXC χημειοκινών και μάλιστα 2 εξ αυτών, οι CXCL8 και CXCL6 φέρουν το ELR αμινοξικό μοτίβο στην αλληλουχία τους και χαρακτηρίζονται από προ-καρκινικές και αγγειογενετικές ιδιότητες. Η τρίτη, η CXCL4, δεν φέρει το εν λόγω μοτίβο και χαρακτηρίζεται ως αγγειοστατική, αν και ο ρόλος της στην συνολική εξέλιξη του όγκου παραμένει σύμφωνα με διάφορες μελέτες αντιφατικός. Εκτός των τριών αυτών χημειοκινών μελετήσαμε και μία κυτταροκίνη, τον αγγειακό ενδοθηλιακό παράγοντα (VEGF) ο οποίος είναι το μόριο με την μεγαλύτερη επίδραση στην αγγειογένεση και χαρακτηρίζεται από ξεκάθαρες προ-καρκινικές ιδιότητες. Η ποσοτικοποίηση των 4 αυτών αγγειοδραστικών χημειοκινών έγινε αρχικά σε ομογενοποιήματα ιστών (καρκινικών και υγιών) προερχομένων εκ του ίδιου ασθενούς και ακολούθησε σύγκριση μεταξύ των τιμών των δυο αυτών ιστών. Επιπλέον των χημειοκινών στους ασθενείς αυτούς μετρήθηκαν και οι γνωστότεροι κλινικοπαθολογοανατομικοί δείκτες (Ki67, p53, p21, bcl2, EGFR και MLH1) και μελετήθηκε πιθανή σύνδεση μεταξύ της έκφρασης των χημειοκινών, της επιβίωσης και των τιμών τους. Επιπλέον σε καλλιέργειες καρκινικών ενδοθηλιακών κυττάρων του έντερου (οι κυτταρικές σειρές HT-29 και Caco2) πραγματοποιήθηκαν επιδράσεις με ορό ασθενών, υγιών και FBS ώστε να μελετηθεί η απόκριση τους αλλά και η βασική τους λειτουργία στα αδιέγερτα controls.Αρχικά στα ιστοτεμάχια με την ανάλυση Western Blot επιβεβαιώσαμε την παρουσία των τεσσάρων αυτών χημειοκινών. Καθώς όμως η ποσοτικοιποίηση είναι εκτός των ορίων της μεθόδου για την επίτευξη της τελευταίας προχωρήσαμε στο επόμενο στάδιο των μετρήσεων.Οι μετρήσεις των χημειοκινών στα ιστοτεμάχια έγιναν με ανοσοενζυμική μέθοδο (ELISA) ενώ οι κλινικοπαθολογοανατομικοί δείκτες ημιποσοτικοποιήθηκαν ανοσοϊστοχημικά. Για την στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων στις μετρήσεις αυτές χρησιμοποιήσαμε τα test Wilcoxon και Χ τετράγωνο.Όσον αφορά τις κυτταρικές σειρές σ αυτές πραγματοποιήθηκαν 4 διαφορετικές επιδράσεις, μία με ορό καρκινοπαθών, μία με ορό υγιών, μία με FBS και τέλος μία με μόνο θρεπτικό υλικό ώστε να δούμε και την βασική τους έκφραση. Οι επιδράσεις σ όλες τις περιπτώσεις έγιναν σε πλάκες καλλιέργειας και σε χρονικό διάστημα 24 hr με ενδιάμεσα χρονικά σημεία μέτρησης στις 2, 4, 6, 12 και 24 ώρες. Όπως και στα ιστοτεμάχια οι μετρήσεις των χημειοκινών στα υπερκείμενα των καλλιεργειών έγιναν με ανοσοενζυμική μέθοδο (ELISA) και η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων με την δοκιμασία one-way ANOVA και με Γενικό Γραμμικό μοντέλο για επαναλαμβανόμενες μετρήσεις.Στα ιστοτεμάχια τα αποτελέσματα μας έδειξαν σημαντική αύξηση των CXCL6 (p=0.005) και VEGF (p-0.003) στα καρκινικά ιστοτεμάχια σε σχέση με τον φυσιολογικό εντερικό βλεννογόνο. Επιπλέον ασθενείς με χαμηλότερες τιμές των CXCL4 και CXCL8 είχαν μεγαλύτερη επιβίωση. Οι ασθενείς με απώλεια της έκφρασης του EGFR βρέθηκαν να παράγουν μεγαλύτερη ποσότητα CXCL8 ενώ η απώλεια της έκφρασης της p21 βρέθηκε να συνδέεται με υψηλότερη ποσότητα CXCL6. Όσον αφορά την κατηγοριοποίηση των καρκίνων κατά Duke’s και TNM δεν προέκυψε κάποια σύνδεσή τους με την παραγωγή των χημειοκινών. Για την p53 ακόμα προέκυψε μειωμένη επιβίωση για τους ασθενής με υψηλή έκφρασή της.Στις μελέτες των καλλιεργειών στις καρκινικές σειρές HT-29 και Caco2 βρέθηκε και για τις δύο έκφραση των αγγειοδραστικών αυτών χημειοκινών ακόμα και στην αδιέγερτη τους κατάσταση. Επιπλέον έκκριση των χημειοκινών αυτών μετρήθηκε και στις διεγερμένες καλλιέργειες τόσο με ανθρώπινο ορό όσο και με FBS. Παρ όλα αυτά η έκφραση των χημειοκινών όχι μόνο δεν ήταν ομοιόμορφη αλλά προέκυψε και ολότελα διαφορετική. Τα HT-29 παράγουν μεγαλύτερη ποσότητα CXCL8 και VEGF ανεξάρτητα της επίδρασης με ορό που εφαρμόσαμε ενώ αντίθετα τα Caco2 φαίνονται να μην αποκρίνονται καθόλου στις επιδράσεις αυτές. Το αντίθετο αποτέλεσμα προέκυψε για τις CXCL6 και CXCL4. Επιπλέον τα HT-29 φαίνονται να παράγουν την μέγιστη ποσότητα CXCL8 στο 24ωρο κατά την επίδραση με ορό ασθενών, επίδραση που έχει το ίδιο αποτέλεσμα στα Caco2 για την CXCL4.