Συμμετοχή του αποπτωτικού μονοπατιού TRAIL στην καρκινογένεση

Abstract

Introduction: Regulated apoptosis is vital for the development and homeostasis and is commonly deregulated during human carcinogenesis. TNF-related, apoptosis-inducing ligand (TRAIL) apoptotic pathway constitutes a promising therapeutic target due to high selectivity and low toxicity of TRAIL targeting agents when administered in combination therapies. TRAIL extrinsic apoptotic pathway consists of the TNF Related Apoptosis Inducing Ligand which can bind on two apoptosis inducing receptors (DR4, DR5), two decoy receptors incapable of transmitting an apoptotic signal (DcR1, DcR2) and a soluble decoy receptor osteoprotegerin (OPG). Inhibitors of TRAIL induced apoptosis include several genes, such as: c-FLIP, XIAP, Mcl-1, Bcl-2 and Bcl-xL. In detail, c-FLIP inhibits DISC formation, Bcl2, Bcl-xL, Mcl-1 inhibit the proapoptotic Bcl-2 family members Bax and Bak, and finally XIAP pre-vents Caspase-3 activation.Materials and Methods: 106 colorectal cancers were examined for relative mRNA expression of genes involved in TRAIL pathway function and regulation (TRAIL, DR4, DR5, DcR1, DcR2, Bcl2, Bcl-XL, Mcl-1, c-FLIP and XIAP) with ΔΔCt analysis. Furthermore, 53 samples were analyzed for mutations in MAPK/ERK genes KRAS (Exons 2,3 and 4), NRAS (Exons 2,3 and 4) and BRAF (exon 15) with Real Time HRM PCR. 44 samples were also analyzed with MS-PCR for decoy receptor (DCR1 and DCR2) promoter methylation in order to assess decoy receptor methylation as a possible expression-reducing mechanism. Additionally, MSI analysis was performed with Real Time HRM-PCR in order to properly assess grading to 14 mucinous adenocarcinomas (according to W.H.O.).Results: Elevated mRNA levels were observed in 66%, 50%, 45%, 33%, 29%, 26%, 15%, 13%, 12% and 10% of the cases for c-FLIP, Bcl-XL, Mcl-1, Bcl2, XIAP, DCR2, DCR1, DR5, DR4 and TRAIL genes respectively. Reduced mRNA levels were detected in 77%, 65%, 64%, 60%, 37%, 33%, 21%, 26%, 20% and 20% of the cases for TRAIL, DR5, DCR1, DR4, DCR2, Bcl2, Bcl-XL Mcl-1 c-FLIP and XIAP genes respectively. Unchanged mRNA levels were detected in 55%, 38%, 34%, 29%, 29%, 28%, 22%, 21%, 14% and 13% of the cases for XIAP DcR2 Bcl2 Bcl-XL Mcl-1 DR4 DR5 DcR1 c-FLIP and TRAIL genes respec-tively. DCR1 and DCR2 promoter methylation was detected in 55% and 16% of the analyzed samples respectively. Mutations in MAPK/ERK pathway genes were detected in 57% of the samples analyzed of which: 45% of the samples were mutated in KRAS, 6% in NRAS and 6% in BRAF. Statistically significant correlations were found between: between DR4 and DR5 elevated relative mRNA expression and tumor stage (inversely, p=0.036, p=0.048 respectively), be-tween XIAP and Mcl-1 elevated relative mRNA expression and T (positively, p=0,059; in-versely, p=0,052), Bcl2 reduced relative mRNA expression and grade, G (positively, p=0,049), c-FLIP and DR5 unchanged relative mRNA expression and gender (with men, p=0,036 and p=0,078 respectively). Strong positive linear correlations mRNA levels were found: c-FLIP/Bcl-XL (p<0,001 και Rs=0,904), c-FLIP/Mcl-1 (p<0,001 και Rs=0,729), DR4/DR5 (R=0.653, p<0.001), XIAP/Mcl-1 (p<0,001 και Rs=0,648) and Mcl-1/Bcl-XL (p<0,001 και R=0,692). .Finally, relative expression of TRAIL was correlated with KRAS, BRAF and NRAS mutation status, defining an inverse correlation between increased TRAIL expression and the absence of mutations in Mitogen-activated protein kinase (MAPK) path-way , and inverse correlations between XIAP reduced mRNA expression and KRAS/NRAS mutations. Conclusions: Simultaneous analysis of TRAIL pathway membrane components, pointed towards a significant deregulation of mRNA expression in colorectal tumours. Multiple expression patterns of TRAIL pathway components in colorectal tumours emerged in the current study, which may possibly be of future use as predictive biomarkers for proper patient selection in order to achieve maximum efficiency with TRAIL targeted therapy in colorectal cancer clinical practice. Further validation of these results in larger patient cohorts is required, as well as further research regarding interactions with other signaling pathways involved in carcinogenesis.

Εισαγωγή: Το αποπτωτικό μονοπάτι TRAIL (TNF related apoptosis inducing ligand, pathway) σχετίζεται με τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (απόπτωση) και συμμετέχει σε φυσιολογικές διαδικασίες του κυττάρου όπως την ανοσοεπιτήρηση του καρκίνου και των μεταστάσεων. Λόγω της ιδιότητας του TRAIL να προκαλεί επιλεκτικά το θάνατο σε καρκινικά κύτταρα, το μονοπάτι αυτό αποτελεί πολλά υποσχόμενο στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου. Έχει όμως παρατηρηθεί αντίσταση στη θεραπεία μέσω TRAIL εξαιτίας ποικιλίας παραγόντων, κάποιες από τις οποίες είναι η διαφορετική έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται με το εξωγενές (DR4, DR5, TRAIL, DcR1, DcR2 και c-FLIP) αλλά και με το ενδογενές αποπτωτικό μονοπάτι (Bcl2, Bcl-XL, Mcl-1 και XIAP), επιγενετικές αλλοιώσεις, καθώς και μεταλλαγές γνωστών γονιδίων που εμπλέκονται με την αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού κατά την καρκινογένεση όπως τα - στοχευόμενα στην κλινική θεραπευτική πρακτική -γονίδια KRAS, BRAF και NRAS του σηματοδοτικού μονοπατιού των MAP κινασών (MAPK/ERK). Επομένως είναι απαραίτητος ο προσδιορισμός βιοδεικτών, βάσει των οποίων θα επιλέγονται οι ασθενείς που μπορεί να έχουν πιθανό όφελος από την χορήγηση της θεραπείας.Υλικά και Μέθοδοι: Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 106 καρκινώματα παχέος εντέρου, εκ των οποίων τα 76 ήταν φρέσκα συντηρημένα στους -20οC και τα 30 μονιμοποιημένα σε RCL2 και εγκλεισμένα σε κύβους παραφίνης. Στην συνέχεια αναλύθηκαν τα σχετικά επίπεδα έκφρασης mRNA των γονιδίων DR4, DR5, TRAIL, DcR1, DcR2, Bcl2, Bcl-XL, Mcl-1, c-FLIP και XIAP με εφαρμογή ημιποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου, και ανάλυση των αποτελεσμάτων με την μέθοδο ΔΔCt. Σε 44 από αυτά τα δείγματα, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της μεθυλίωσης του υποκινητή των γονιδίων DcR1 και DcR2, με σκοπό την διερεύνηση της ως πιθανού μηχανισμού αποσιώπησης της έκφρασης στα δείγματα με μειωμένα επίπεδα σχετικής έκφρασης mRNA. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε ενδεικτικά σε 10 δείγματα, η ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων των υποδοχέων κυτταρικού θανάτου DR4/5, με σκοπό την ενδεικτική επιβεβαίωση των σχετικών επιπέδων έκφρασης mRNA σε επίπεδο πρωτεΐνης. Σε 53 δείγματα παχέος εντέρου, πραγματοποιήθηκε ανάλυση των μεταλλαγών των γονιδίων KRAS, BRAF και NRAS του σηματοδοτικού μονοπατιού MAPK/ERK, αρχικά με την μέθοδο της HRM-PCR και με την μέθοδο της πυροαλληλούχισης για τον τελικό προσδιορισμό της αλληλουχίας τους.Αποτελέσματα: Ανιχνεύθηκε για τα γονίδια DR4, DR5, TRAIL, DcR1, DcR2, Bcl2, Bcl-XL, Mcl-1 και XIAP: α) υπερέκφραση σε ποσοστό αντίστοιχα για κάθε γονίδιο σε ποσοστά 12% (12 από τα 101), 13% (14 από τα 105), 10% (8 από τα 77), 15% (16 από τα 105), και 25% (24 από τα 97), 33% (28 από τα 92), 50% (38 από τα 76), και 45% (42 από τα 96), 66% (65 από τα 96) και 29% (28 από τα 97) αντίστοιχα β) υποέκφραση σε ποσοστά 60% (61 από τα 101), 65% (68 από τα 105), 77% (59 από τα 77), 64% (67 από τα 105), 37% (36 από τα 97), 33% (32 από τα 92), 21% (16 από τα 76), 26% (24 από τα 96), 20% (20 από τα 96) και 20%(20 από τα 97) αντίστοιχα γ) σταθερή έκφραση σε ποσοστά 28%(28 από 101), 22% (23 από τα 105), 13% (10 από 77), 21% (22 από 105), 38% (23 από τα 105), 34% (32 από 92), 29% (22 από 76), 29% (30 από τα 96), 14% (11 από 96) και 20% (20 από τα 97) αντίστοιχα. Παρατηρήθηκαν θετικές γραμμικές συσχετίσεις μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων σε στατιστικά σημαντικό βαθμό, αρκετές από τις οποίες ισχυρές (Spearmann’s rho συντελεστής συσχέτισης Rs>0,6 και p<0,001). Ακόμα, 55% των δειγμάτων που αναλύθηκαν (24 από τα 44) παρουσίασε μεθυλίωση του εκκινητή του γονιδίου DcR1 και 16% των δειγμάτων (7 από τα 44 δείγματα) μεθυλίωση του εκκινητή του γονιδίου DcR1. Επίσης στο 57% των δειγμάτων που αναλύθηκαν, ανιχνεύτηκαν μεταλλαγές των γονιδίων του μονοπατιού MAPK/ERK εκ των οποίων: το 45% ανιχνεύτηκαν στο γονίδιο KRAS, το 6% στο γονίδιο BRAF και τo 6% στο γονίδιο NRAS. Επίσης. εντοπίστηκαν συσχετίσεις των αποτελεσμάτων με τα κλινικοπαθολογικά δεδομένα μεταξύ: της έκφρασης των γονιδίων DR4 και DR5 και του σταδίου κατά ΤΝΜ (p=0,036 και p=0,048 αντίστοιχα), της έκφρασης του γονιδίου DcR2 και του βλεννώδους ιστολογικού τύπου (p=0,015), της έκφρασης του γονιδίου Bcl2 και του βαθμού κακοήθειας G (p=0,049), της έκφρασης των γονιδίων Mcl-1 και XIAP και του μεγέθους πρωτοπαθούς εστίας Τ (p=0,059 και p=0,052 αντίστοιχα), της έκφρασης των γονιδίων DR5 και c-FLIP του φύλου (p=0,036 και p=0,078 αντίστοιχα) και μεταξύ των μεταλλαγών του γονιδίου KRAS και του βαθμού εξάπλωσης στους λεμφαδένες (p=0,026), του σταδίου TNM (p=0,029) και του βαθμού κακοήθειας G (p=0,015). Τέλος παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ: των μεταλλαγών των γονιδίων KRAS και των σχετικών επιπέδων έκφρασης των γονιδίων TRAIL και XIAP (p=0,041 και p=0,085 αντίστοιχα) και μεταξύ των μεταλλαγών του γονιδίου NRAS και των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου XIAP (p=0,026).Συμπεράσματα: Για την επιλογή των κατάλληλων ασθενών η οποίοι θα έχουν όφελος από τη χορήγηση θεραπειών που στοχεύουν στο αποπτωτικό σηματοδοτικό μονοπάτι TRAIL είναι σημαντική η ανεύρεση προβλεπτικών βιοδεικτών. Τα διαφορετικά μοτίβα έκφρασης των αποπτωτικών και αντιαποπτωτικών γονιδίων του μονοπατιού TRAIL που αναδείχτηκαν στη μελέτη αυτή μπορούν μελλοντικά να χρησιμοποιηθούν ως προβλεπτικοί βιοδείκτες στην κλινική πράξη για την αποτελεσματική θεραπευτική στόχευση του μονοπατιού TRAIL σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Για το λόγο αυτό απαιτείται η επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων σε μεγαλύτερες ομάδες ασθενών, καθώς η περεταίρω διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων με άλλα σηματοδοτικά μονοπάτια.