Ο ρόλος των φυτοχημικών ενώσεων στην τροποποίηση της δράσης των χημειοθεραπευτικών παραγόντων

Abstract

Phytochemicals are a group of chemical molecules found in plants. Flavonoids, non-flavonoid phytochemicals and chemotherapeutic cisplatin were studied. The aim of this study was to investigate the effect of selected phytochemical substances alone and in combination with the chemotherapeutic drug cisplatin. The ability of these substances to inhibit cell proliferation was studied in cancer cell lines using the MTT staining technique. Epigallocatechin, quercetin and curcumin showed stronger antitumor activity in LMS cell line. The activity of phytochemicals was also studied in Η1299 cell line of lung cancer. The strongest activity among phytochemicals in H1299 cells was shown by curcumin. Moreover, pre-incubation of two cell lines (LMS and H1299) with phytochemicals was performed and then cisplatin was added. An increase in the activity of cisplatin when LMS cells were pre-incubated with quercetin, epigallocatechin and curcumin was observed. The same result was observed in H1299 cell line when cells were pre-incubated with all phytochemicals. Moreover, it was studied the effect of phytochemicals, cisplatin, and the combination of cisplatin and phytochemicals in normal cell line of fibroblasts (MRC-5). We concluded that flavonoids had greater toxicity in tumor cell lines, and exhibited no toxic effect in normal cells. According to flow cytometry results, cisplatin triggered apoptotic death in LMS cells. Also it was observed that pre-incubation of LMS cells with epigallocatechin, quercetin, gallic acid and curcumin enhanced apoptosis of cells compared to cisplatin. Moreover, it was performed cell cycle analysis in a flow cytometer. Administration of cisplatin resulted in S –phase cell cycle arrest, while after pre-incubation with phytochemicals the cells remained in growth phase (G0/G1).To determine the metabolic capacity of mitochondria in live cells we used Mitochondrial Viability Stain kit. It was observed that cisplatin induced inhibition of mitochondrial function, while the combination of cisplatin and phytochemicals enhanced this inhibition. The enhanced activity of cisplatin was concluded after pre-incubation of cancer cells with specific phytochemical compounds, among which curcumin showed the greatest efficiency.Moreover, in vivo study of the toxicity of cisplatin and curcumin in Wistar Rats was performed. Administration of curcumin, prior and after the injection of cisplatin, decreased the level of Malonic Dialdehyde (MDA), induced by cisplatin. Also, we observed that the chemotherapeutic agent cisplatin caused a decrease in the activity of SOD and GPx enzymes. The administration of curcumin in combination with the drug may retain the inherent defensive action of antioxidant enzymes. Finally, blood tests were performed and various hematological and biochemical markers were analyzed. Administration of curcumin resulted in a recovery of the function of organism, as it was revealed from the analysis of the hematological and biochemical markers, compared to those animals who received only cisplatin. The histopathological study of rats showed that cisplatin caused nephrotoxicity rather than hepatotoxicity, and curcumin administration, before and after the drug, appeared to attenuate these effects.Overall, administration of curcumin seems to attenuate the toxic effect of cisplatin and its effectiveness is greater when the phytochemical is administered before and after the dose of cisplatin.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν τα φλαβονοειδή κουερσετίνη, επιγαλοκατεχίνη, ρουτίνη και ναρινγίνη, οι μη-φλαβονοειδείς πολυφαινόλες, όπως η ρεσβερατρόλη, το γαλλικό οξύ και η κουρκουμίνη, καθώς και το χημειοθεραπευτικό σισπλατίνη. Σκοπός της μελέτης ήταν η διαλεύκανση της επίδρασης των φυτοχημικών ενώσεων στην τοξική δράση της σισπλατίνης σε κυτταρικό επίπεδο και σε επίπεδο πειραματοζώων. Αρχικά, μελετήθηκε η αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού από τα φυτοχημικά, καθώς και του συνδυασμού φυτοχημικών και σισπλατίνης σε καρκινικές κυτταρικές σειρές με τη μέθοδο MTT. Η επιγαλοκατεχίνη, η κουερσετίνη και η κουρκουμίνη εμφάνισαν την ισχυρότερη αντικαρκινική δράση στα LMS κύτταρα. Η δράση των φυτοχημικών ουσιών μελετήθηκε και στην κυτταρική σειρά Η1299, καρκίνου του πνεύμονα, όπου την πιο ισχυρή δράση παρουσίασε η κουρκουμίνη. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε προεπώαση των δυο κυτταρικών σειρών (LMS και H1299) με τα φυτοχημικά και έπειτα πραγματοποιήθηκε προσθήκη σισπλατίνης. Η προεπώαση των κυττάρων με πολύ μικρή και μη τοξική δόση φυτοχημικών, όπως η κουερσετίνη, η κουρκουμίνη, το γαλλικό οξύ και η επιγαλοκατεχίνη, αύξησαν τη κυτταροτοξική δράση της σισπλατίνης στα LMS κύτταρα. Ίδιο αποτέλεσμα παρατηρείται και για τα H1299 κύτταρα, όταν προεπωάζονται με όλες τις φυτοχημικές ουσίες. Συμπερασματικά, φαίνεται ότι μετά από προεπώαση με φυτοχημικά απαιτείται η χορήγηση μικρότερης δόσης σισπλατίνης για να επιτευχθεί η τιμή IC50 της. Οι δοκιμές των φυτοχημικών ουσιών, της σισπλατίνης, και του συνδυασμού σισπλατίνης και φυτοχημικών στη φυσιολογική κυτταρική σειρά ΜRC-5 (ινοβλάστες) έδειξαν ότι οι φυτοχημικές ενώσεις έχουν μεγαλύτερη τοξικότητα στις καρκινικές κυτταρικές σειρές και δεν επηρεάζουν τα φυσιολογικά κύτταρα. Ο προσδιορισμός του μηχανισμού με τον οποίο επάγεται ο κυτταρικός θάνατος στα LMS κύτταρα μετά τη χορήγηση σισπλατίνης, πραγματοποιήθηκε με χρήση κυτταρομετρίας ροής και παρατηρήθηκε ότι διενεργείται μέσω της απόπτωσης. Επίσης, παρατηρείται ότι προεπώαση των LMS κυττάρων με επιγαλοκατεχίνη, κουερσετίνη, γαλλικό οξύ και κουρκουμίνη αύξησε επιπλέον την απόπτωση των κυττάρων συγκριτικά με τη σισπλατίνη. Μετά από ανάλυση του κυτταρικού κύκλου στα LMS κύτταρα, η χορήγηση σισπλατίνης, έδειξε να αυξάνει το ποσοστό των κυττάρων στην S φάση, ενώ η προεπώαση των κυττάρων με τα φυτοχημικά δείχνει ότι τα κύτταρα παραμένουν στην φάση ανάπτυξης (G0/G1). Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση φυτοχημικών, της σισπλατίνης και του συνδυασμού αυτών στις οξειδο-αναγωγικές αντιδράσεις των μιτοχονδρίων. Η σισπλατίνη προκάλεσε αναστολή στη λειτουργία των μιτοχονδρίων και η προεπώαση των κυττάρων με τα φυτοχημικά ενίσχυσε τη δράση του φαρμάκου. Συμπεραίνεται ότι η δράση της σισπλατίνης ενισχύεται στα καρκινικά κύτταρα μετά από προεπώαση τους με συγκεκριμένες φυτοχημικές ενώσεις, ανάμεσα στις οποίες η κουρκουμίνη επέδειξε τη μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα.Ακολούθησε η in vivo μελέτη της τοξικότητας της σισπλατίνης και της κουρκουμίνης σε επίμυες Wistar Rats. Η χορήγηση κουρκουμίνης πριν από τη δόση σισπλατίνης, όπως και όταν χορηγείται πριν και μετά τη σισπλατίνη, αποδείχθηκε ότι μειώνει τα αυξημένα επίπεδα μαλονικής διαλδεϋδης(MDA), που προκαλούνται από σισπλατίνη. Επίσης, παρατηρήθηκε ότι η σισπλατίνη προκάλεσε μείωση στη δραστηριότητα της SOD και της GPx. Η χορήγηση κουρκουμίνης στα σχήματα συνδυασμού με το χημειοθεραπευτικό μπορεί να διατηρεί την ενδογενή αμυντική δράση των αντιοξειδωτικών ενζύμων. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η ανάλυση διαφόρων αιματολογικών και βιοχημικών δεικτών στα πειραματόζωα. Η χορήγηση κουρκουμίνης επέφερε μια ανάκαμψη στη λειτουργία του οργανισμού, όπως φανέρωσε η ανάλυση των αιματολογικών και σε μικρότερο βαθμό των βιοχημικών δεικτών των πειραματοζώων σε σύγκριση με αυτούς των ζώων που έλαβαν μόνο σισπλατίνη. Η ιστοπαθολογική μελέτη των επίμυων έδειξε ότι η σισπλατίνη φαίνεται να προκαλεί πιο έντονη νεφροτοξικότητα παρά ηπατοτοξικότητα, και η χορήγηση κουρκουμίνης πριν και μετά από το φάρμακο δείχνει να εξασθενεί αυτές τις επιπτώσεις. Συνολικά, η χορήγηση κουρκουμίνης φαίνεται ότι μετριάζει την τοξική επίδραση της σισπλατίνης και η αποτελεσματικότητα της είναι μεγαλύτερη όταν χορηγείται πριν και μετά τη δόση του φαρμάκου.