Κλινική αξιολόγηση του νέου αποπτωτικού γονιδίου BCL2L12 στον καρκίνο του μαστού ως μοριακού δείκτη πρόγνωσης και ανταπρόκρισης στη χημειοθεραπεία

Abstract

OBJECTIVES: BCL2-like 12 (BCL2L12) is a new member of the BCL2 gene family that was discovered and cloned by members of our group and found to be expressed in the mammary gland. Many genes of the BCL2 family were found to be implicated in breast carcinogenesis and to serve as possible prognostic markers. The aim of the present study was the quantification of BCL2L12 mRNA expression in order to assess its value as a prognostic tissue biomarker in breast cancer (BC).DESIGN AND METHODS: BCL2L12 mRNA levels were determined in a statistically significant sample size of cancerous (N=108) and adjacent non-cancerous (N=71) breast tissues using a highly sensitive quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) method. Relative quantification analysis was conducted using the comparative CT (2(-ΔΔC)T) method, whereas the association between BCL2L12 expression and clinopathological data, disease-free survival (DFS) and overall survival (OS) were estimated by statistical analysis.RESULTS: BCL2L12 mRNA expression was decreased in malignant samples compared to the histologically normal counterparts (p=0.012). Significant relationships between BCL2L12 expression and TNM stages (p=0.009), metastatic potential (p=0.012), tumor size (p=0.04) and age (p=0.024) were observed. Moreover, Kaplan-Meier and Cox univariate analyses indicated that BCL2L12 expression is associated with longer DFS, whereas multivariate analysis pointed out the independent favorable prognostic value of BCL2L12.CONCLUSIONS: According to our results, BCL2L12 mRNA expression is a favorable prognostic marker of DFS for BC patients, suggesting its possible application as a novel prognostic indicator of this malignancy.

Σε παγκόσμιο επίπεδο ο καρκίνος του μαστού συνεχίζει να αποτελεί το πιο συχνά διαγιγνωσκόμενο νεόπλασμα στον γυναικείο πληθυσμό. Η έλευση της γενωμικής καθιέρωσε την εφαρμογή μοριακών μεθοδολογιών υψηλής απόδοσης και βοήθησε σημαντικά προς αυτήν την κατεύθυνση μέσω της δημιουργίας του γονιδιακού προφίλ του κάθε όγκου ξεχωριστά. Ο τελικός στόχος αυτών των προσεγγίσεων είναι η πιο αξιόπιστη πρόγνωση και επιλογή της κατάλληλης θεραπείας και κατά συνέπεια η μείωση της νοσηρότητας αλλά κυρίως της θνησιμότητας.Το γονίδιο BCL2L12 είναι ένα νέο μέλος της BCL2 οικογένειας, που ανακαλύφθηκε και κλωνοποιήθηκε από τους Scorilas et al. το έτος 2001. Χαρτογραφείται στη θέση 19q13.3, και πρόσφατα βρέθηκε ότι το εναλλακτικό μάτισμα του συγκεκριμένου γονιδίου οδηγεί στη γένεση 13 εναλλακτικών μεταγράφων. Το γνωστό σαν "κλασσικό" μετάγραφο αποτελείται από 7 εξώνια και κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 334 αμινοξέων, πλούσια σε προλίνη, με μοριακό βάρος 36,8 kDa, που περιέχει μια συντηρημένη BH2 περιοχή της οικογένειας BCL2. Η έκφραση του BCL2L12 σε επίπεδο mRNA έχει αναλυθεί σε διάφορους τύπους καρκίνου και βρέθηκε να αποτελεί έναν στατιστικά σημαντικό μοριακό δείκτη πρόγνωσης.Στην παρούσα εργασία, διεξήχθη μελέτη της έκφρασης σε επίπεδο mRNA του BCL2L12 στον καρκίνο του μαστού. Η πιθανή μελλοντική εφαρμογή τους, ως μοριακός δείκτης του καρκίνου του μαστού, ίσως συμβάλλει στην καλύτερη πρόγνωση και σταδιοποίηση της νόσου, καθώς και στην επιλογή της καταλληλότερης συστηματικής χημειοθεραπευτικής αγωγής. Για το σκοπό αυτό, συλλέχθηκαν καρκινικά και φυσιολογικά δείγματα μαστού, ενώ κατασκευάστηκε λεπτομερής βάση δεδομένων με κλινικοπαθολογικά στοιχεία για κάθε ασθενή. Ακολούθως, έλαβαν χώρα η σύνθλιψη και η ομογενοποιήση των δειγμάτων ιστού, η απομόνωση του ολικού RNA, ο έλεγχος της ποιότητάς του, καθώς και η σύνθεση του συμπληρωματικού DNA (cDNA) με την μέθοδο της αντίστροφης μεταγραφής. Έπειτα, πραγματοποιήθηκε συμβατική PCR και ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της αντίδρασης σε πήκτωμα αγαρόζης για τον έλεγχο της έκφρασης του BCL2L12, ενώ για τον ποσοτικό προσδιορισμό των mRNA επιπέδων του ίδιου γονιδίου, αναπτύχθηκε μια πολύ ευαίσθητη μέθοδος ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου, χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης SYBR Green. Στη συνέχεια τα αποτελέσματα της ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου υποβλήθηκαν σε εκτενή στατιστική ανάλυση. Παράλληλα μελετήθηκε η επίδραση των αντικαρκινικών παραγόντων Docetaxel και Navelbine, στην έκφραση του BCL2L12 στην ανθρώπινη κυτταρική καρκινική σειρά μαστού MCF-7. Αρχικά προσδιορίστηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων MCF-7, παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων των παραπάνω παραγόντων με τη μέθοδο ΜΤΤ, ακολουθώντας στη συνέχεια απομόνωση του ολικού RNA, έλεγχος της ποιότητάς του, καθώς και σύνθεση του συμπληρωματικού DNA (cDNA) με την μέθοδο της αντίστροφης μεταγραφής. Τέλος, πραγματοποιήθηκε έλεγχος της έκφρασης σε επίπεδο mRNA του εξεταζόμενου γονιδίου με τη μέθοδο της ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου ενώ και σε αυτήν την περίπτωση χρησιμοποιήθηκε το HPRT1 ως γονίδιο αναφοράς.Σύμφωνα με τη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων για την ποσοτική ανάλυση της έκφρασης mRNA του BCL2L12 παρατηρείται μια στατιστικά σημαντική αύξηση (p=0.012) του BCL2L12 στους μη καρκινικούς ιστούς μαστού σε σύγκριση με τους παρακείμενους καρκινικούς. Η ανάλυση της συσχέτισης της mRNA έκφρασης του BCL2L12 με τις διάφορες κλινικοπαθολογικές παραμέτρους επιβεβαίωσε ότι η υπερέκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου συνδέεται με λιγότερο επιθετικές μορφές της νόσου. Πιο αναλυτικά, τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του BCL2L12 σχετίζονται με αρχικό στάδιο της νόσου (p=0.009), απουσία μεταστάσεων (p=0.012), με μικρό μέγεθος όγκου (p=0.04) καθώς και με την ηλικία της ασθενούς τη στιγμή της διάγνωσης (p=0.024). Επίσης, η μονομεταβλητή ανάλυση της σχέσης μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του εξεταζόμενου γονιδίου και της επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο του μαστού αποκάλυψε ότι η έκφραση του γονιδίου BCL2L12, συνιστά ένα σημαντικό προγνωστικό δείκτη για την DFS (p=0.030). Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώθηκε κι από την ανάλυση Kaplan-Meier, αφού οι ασθενείς που χαρακτηρίστηκαν θετικές ως προς την έκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου είχαν στατιστικά σημαντική μεγαλύτερη πιθανότητα επιβίωσης χωρίς υποτροπές (p=0.015). Παράλληλα, η πολυμετάβλητη ανάλυση της σχέσης των επιπέδων έκφρασης του BCL2L12 και της επιβίωσης των γυναικών με καρκίνο του μαστού φανέρωσε μία στατιστικώς σημαντική προγνωστική αξία του BCL2L12 για την ελεύθερη νόσου (p=0,048), όχι όμως και για την ολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο μαστού. Το γεγονός αυτό συνεπάγεται τη δυνατότητα χρήσης της έκφρασης σε mRNA επίπεδο του συγκεκριμένου γονιδίου σαν ένα ανεξάρτητο δείκτη πρόγνωσης της DFS. Στα πλαίσια της συγκεκριμένης διατριβής έγινε μία πρώτη προσπάθεια διερεύνησης της επίδρασης των χημειοθεραπευτικών παραγόντων Docetaxel και Navelbine στην έκφραση τριών εναλλακτικών μεταγράφων του BCL2L12. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε σαν μοντέλο μελέτης της επίδρασης αυτών των φαρμάκων τα καρκινικά κύτταρα μαστού MCF-7 και με τη μεθοδολογία της συμβατικής PCR μελετήθηκε η έκφραση του ολικού BCL2L12 καθώς και των μεταγράφων BCL2L12 v.4 και BCL2L12 v.5. Η ηλεκτροφορητική ανάλυση των δειγμάτων αποκάλυψε τη διαφορική έκφραση των BCL2L12 μεταγράφων στην καρκινική κυτταρική σειρά MCF-7 η οποία δεν ακολουθεί ένα συγκεκριμένο πρότυπο. Αντίθετα, φαίνεται ότι οι παρατηρούμενες διακυμάνσεις στην έκφραση των εξεταζόμενων γονιδίων είναι εξαρτώμενες του μηχανισμού δράσης κάθε φαρμακευτικής ουσίας και κατ’ επέκταση του αποπτωτικού μονοπατιού που επάγεται και τέλος του χρονικού διαστήματος που αυτή παρέχεται. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας ανέδειξαν τη σημασία του BCL2L12 στη μελέτη του καρκίνου του μαστού και προτείνουν την εν δυνάμει εφαρμογή του στη διάγνωση, την πρόγνωση και την ακριβέστερη σταδιοποίηση της νόσου.