Ανακάλυψη αναστολέων για την πρωτεΐνη TNF-α σαν ενώσεις οδηγούς για φάρμακα έναντι της ρευματοειδoύς αρθρίτιδας

Abstract

The subject of this thesis is the discovery of novel small-molecule inhibitors of Tumor Necrosis Factor (TNF). TNF has been related to autoimmune diseases such as psoriasis, Crohn’s disease, Alzheimer’s disease and plays a pivotal role in Rheumatoid Arthritis pathogenesis. Anti-TNF therapy is used for diseases such as ankylotic spondylitis, rheumatoid and psoriatic arthritis, psoriasis, inflammatory bowel disease etc. SPD304 is a small molecule that inhibits the activity of TNF by interacting with the protein trimer, promoting protein detrimerization and thus an inactivated dimer is formed in complex with SPD304. SPD304 is toxic and for this reason it can not be utilized as a drug for anti-TNF therapy but only as a basis for the discovery of new small-molecule inhibitors that prevent protein trimerization. Thus, the development of small-molecule TNF inhibitors remains a desirable goal.The subject of RAlead project was the discovery of small-molecule TNF inhibitors and for this purpose a series of SPD304 analogs was designed and synthesized aiming at the elimination of toxicity and the enhancement of activity. Additionally, commercially available compounds that have risen from docking studies as well as compounds designed on the basis of the results of the binding assays were studied.For the evaluation of the potential inhibitors the dissociation constant (Kd) was measured with fluorescence spectroscopy. The binding mechanism was studied with Isothermal Titration Calorimetry (ITC). The binding mode of SPD304 to TNF protein used for the binding assays, was studied with X-ray crystallography. For all the assays above, TNF was expressed as a GST-protein in E-coli cells and purified according to the protocol that was developed. A serious problem that has risen during this study was the low aqueous solubility of the studied compounds. Techniques on solubility enhancement were studied and a solubilization protocol for small molecules was developed. This protocol was adapted to the binding assay in order to be compatible with the assay and the protein. Except for in vitro biochemical assays such techniques can be a powerful tool in crystallization of protein complexes with small molecules.A series of 86 SPD304 analogues were studied together with 60 potential inhibitors derived from docking studies. The majority of these compounds was not soluble enough for the measurent of dissociation constant. With solubility enhancement most of them became sufficiently soluble and the binding studies took place. During solubility studies different cosolvents (DMSO, PEG3350) and other additives (β-cyclodextrin) were tested and it was shown that PEG3350 is more effective than DMSO for moderately insoluble compounds while β-cyclodextrin is efficient even for extremely insoluble compounds. Furthermore, factors that affect solubility such as dissolution time, initial state of the compound and filtering of the sample before the measurement were studied.Binding studies showed that 30 compounds were more active than SPD304 (<5μM) and 20 more had similar activity with SPD304 (~5μM). Some of them had also decreased toxicity. The percentage of the compounds that were initially insoluble in aqueous solutions was calculated at 76% and after the solubility studies it decreased to 20%. This means that finally 80% of the compounds was soluble enough for the binding assays.An aqueous solubility prediction model was developed (Novamechanics) which was based on the above results. This predictive Quantitative Structure Property Relationship model categorizes soluble from insoluble compounds. It aims at solubility prediction of small-molecule candidate inhibitors of TNF in aqueous solutions with 5% DMSO. The simplicity of the proposed method makes it broadly applicable to virtual screening and data mining in order to identify soluble molecules.

Αντικείμενο της παρούσας διατριβής είναι η ανακάλυψη νέων μικρομοριακών αναστολέων για τον Παράγοντα Νέκρωσης Όγκων (Tumour Necrosis Factor, TNF). Ο TNF έχει συσχετισθεί με αυτοάνοσες διαταραχές όπως ψωρίαση, νόσος του Crohn, νόσος του Alzheimer και παίζει καθοριστικό ρόλο στην παθογένεια της ρευματοειδούς αρθρίτιδας. Η αντι-TNF θεραπεία χρησιμοποιείται για ασθένειες όπως η αγκυλοποιητική σπονδυλαρθρίτιδα, η ρευματοειδής και ψωριασική αρθρίτιδα, η ψωρίαση, η φλεγμονώδης νόσος του εντέρου κ.ά. Το SPD304 είναι ένα μικρό μόριο που αναστέλλει τη δράση του TNF καθώς αλληλεπιδρά με το τριμερές της πρωτεΐνης, προωθεί τον αποτριμερισμό της και έτσι προκύπτει ένα ανενεργό διμερές. Το SPD304 είναι τοξικό και για τον λόγο αυτό δεν είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί σαν φαρμακευτική ουσία στην αντι-TNF θεραπεία αλλά σαν βάση για την ανακάλυψη νέων μικρομοριακών αναστολέων που εμποδίζουν τον τριμερισμό της πρωτεΐνης. Επομένως, η ανάπτυξη μικρομοριακών αναστολέων του TNF χαμηλής τοξικότητας παραμένει ένας διακαής στόχος.Το αντικείμενο του προγράμματος RAlead ήταν η ανακάλυψη μικρομοριακών αναστολέων του TNF και σε αυτό το πλαίσιο σχεδιάστηκε και συντέθηκε μια σειρά αναλόγων του SPD304 με σκοπό τη μείωση της τοξικότητας και την ενίσχυση της βιοδραστικότητας. Επιπρόσθετα, μελετήθηκαν εμπορικά διαθέσιμες ενώσεις που προέκυψαν από in silico μελέτες ελλιμενισμού (docking studies) αλλά και ενώσεις που σχεδιάστηκαν βάσει των ενδιάμεσων αποτελεσμάτων των μελετών πρόσδεσης. Για την αξιολόγηση των πιθανών προσδετών μετρήθηκε η σταθερά διάσπασης (dissociation constant, Kd) με φασματοσκοπία φθορισμού. Παράλληλα, μελετήθηκε ο μηχανισμός πρόσδεσης με την τεχνική της Ισόθερμης Θερμιδομετρίας Τιτλοδότησης (ITC). Επίσης μελετήθηκε κρυσταλλογραφικά ο τρόπος πρόσδεσης του SPD304 στην πρωτεΐνη TNF που χρησιμοποιήθηκε και στις μελέτες πρόσδεσης. Για όλες τις παραπάνω μελέτες προηγήθηκε έκφραση του TNF σε κύτταρα E-coli και καθαρισμός βάσει ενός πρωτόκολλου που αναπτύχθηκε.Ένα σοβαρό πρόβλημα που εμφανίστηκε και αντιμετωπίστηκε με επιτυχία κατά τη διάρκεια αυτής της εργασίας, ήταν η χαμηλή υδατική διαλυτότητα των υπό μελέτη ουσιών. Μελετήθηκαν συγκεκριμένες τεχνικές για την ενίσχυση της διαλυτότητας και δημιουργήθηκε ένα πρωτόκολλο διάλυσης μικρών μορίων. Το πρωτόκολλο αυτό διαμορφώθηκε έτσι ώστε να είναι συμβατό με τις βιοχημικές δοκιμές πρόσδεσης όπως και με την πρωτεΐνη. Εκτός από τις in vitro βιοχημικές δοκιμές οι τεχνικές αυτές μπορούν να αποτελέσουν ένα δυνατό εργαλείο και στην κρυστάλλωση πρωτεϊνικών συμπλόκων με μικρά φαρμακευτικά μόρια. Μελετήθηκε μια σειρά 86 αναλόγων του SPD304 καθώς και μία σειρά 60 πιθανών αναστολέων που προέκυψαν από μελέτες ελλιμενισμού. Η πλειοψηφία των μορίων αυτών δεν ήταν αρκετά υδατοδιαλυτή έτσι ώστε να μετρηθεί η σταθερά διάσπασης. Με τις μελέτες διαλυτότητας κατέστη δυνατό οι περισσότερες από αυτές να διαλυθούν αρκετά έτσι ώστε να είναι δυνατή η μέτρηση της σταθεράς διάσπασης. Στο πλαίσιο των μελετών διαλυτότητας αξιολογήθηκε η επίδραση της προσθήκης συνδιαλυτών (DMSO, PEG3350) και άλλων προσθέτων (β-κυκλοδεξτρίνης) όπου φάνηκε ότι η PEG3350 είναι πιο αποτελεσματική από το DMSO για μετρίως αδιάλυτα μόρια και ότι η β-κυκλοδεξτρίνη είναι καταλληλότερη σε περιπτώσεις εξαιρετικά αδιάλυτων μορίων. Επίσης μελετήθηκε η επιρροή του χρόνου διάλυσης, της αρχικής φάσης των χημικών ενώσεων (στερεή/ υγρή) και του φιλτραρίσματος των δειγμάτων πριν από τη μέτρηση της διαλυτότητας. Οι μελέτες δραστικότητας ανέδειξαν περίπου 30 ενώσεις με δραστικότητα καλύτερη εκείνης του SPD304 (<5μM) και 20 ενώσεις με εφάμιλλη του SPD304 δραστικότητα (~5μM). Μερικές από αυτές είχαν σαφώς μειωμένη τοξικότητα. Το ποσοστό των ενώσεων που ήταν αδιάλυτες σε καθαρά υδατικά διαλύματα το οποίο είχε υπολογιστεί σε 76%, βάσει των μελετών διαλυτότητας, με τη χρήση συνδιαλυτών και άλλων τεχνικών ενίσχυσης της διαλυτότητας μειώθηκε σε 20%. Αυτό σημαίνει ότι έγινε εφικτή η ικανοποιητική διάλυση του 80% των ενώσεων έτσι ώστε να είναι δυνατή η μέτρηση της σταθεράς διάσπασής τους. Με βάση τα διαθέσιμα δεδομένα διαλυτότητας δημιουργήθηκε ένα μοντέλο πρόβλεψης διαλυτοτήτων (Novamechanics) το οποίο στηρίζεται στην ταξινόμηση διαχωρίζοντας τις αδιάλυτες από τις διαλυτές ενώσεις. Το μοντέλο Ποσοτικής Συσχέτισης Δομής Ιδιότητας (predictive Quantitative Structure Property Relationship model) στοχεύει στην πρόβλεψη της διαλυτότητας πιθανών μικρομοριακών αναστολέων του TNF σε υδατικά διαλύματα παρουσία 5% DMSO. Η απλότητα της προτεινόμενης μεθόδου την καθιστά ευρέως εφαρμόσιμη σε υπολογιστική διαλογή (virtual screening) και εξαγωγή δεδομένων (data mining) για την ταυτοποίηση διαλυτών μορίων.