Πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρωπίνων κυττάρων ήπατος: μελέτη αλληλεπιδράσεων με κύτταρα ανοσοποιητικού συστήματος: παρουσία φλεγμονωδών παραγόντων

Abstract

The rich blood supply of the liver, approximately 1500ml/min, results in allblood components, including plasma and monocytes, circulating constantly insidethe sinusoids. The dominant aspect today is that there is continuous contactbetween hepatocytes and mononuclear cells through cytoplasmic projections; thiscontact though depends on factors that can change the endothelial fenestrations’diameter, such as the presence of inflammation.Our aim is to investigate the interactions between hepatocytes andhomologous mononuclear cells in vitro, when the two populations are in co‐culturewithout the endothelial barrier and intwo chosen ratios. In the 5:1ratio(hepatocytes/monocytes), which mimics the normal in vivo ratio, the co‐cultureof cell populations has no substantial impact on their viability or activation.However, in the 1:1 ratio which resembles the acute inflammation ratio, theinteractions between cells in respect to their viability and activation, display adifferent pattern. This implies different ratios of contact between cells may beenough to trigger different interactions, even in the absence of an inflammatoryfactor.We then tried to investigate the impact of changing the characteristics ofanother physiological encounter: the encounter of hepatocytes and monocytes withlipopolysaccharide(LPS).Human portal vein LPS blood concentrations range normallyfrom 10pg/ml to1ng/ml. In our experiments we first tested the effect of differentLPS concentrations on monocultures. The addition of LPS led to early reduction ofmean viability and albumin production by hepatocytes, as well as reduction of meanviability and up‐regulation of mean activation of CD4+ and CD8+ cells. The power ofLPS effect was shown to be dose and time dependent in a non‐linear fashion, and itwas also found to be a dynamic phenomenon which takes place in consequent cycles, probably in accordance with different cycles of attachment and detachmentof LPS to its receptors on both cell types. The statistical analysis showed also thatLPS effect on viability and activation is more prominent on CD4+ than CD8+ cells. We finally investigated the effect of LPS on hepatocyte‐monocyte co‐culturesat a ratio of 1:1. The effects of LPS on co‐cultures were found to be similar to thoseobserved in monocultures, they were however more prominent and continuous.In conclusion, the interactions between hepatocytes and monocytes in coculturecan be altered by simply changing the ratio of the co‐culture, which supportsthe fact that hepatocytes and monocytes continuously perceive and respond tominimal changes of their environment. In addition, the effect of different LPSconcentrations has a similar pattern on each cell population, but each sampledisplays a unique behavior which apparently depends on donor immunologicalstatus as well as on other factors not always known or easily controlled even invitro.LPS factor has a cytotoxic effect on hepatocytes and monocytes, but LPSconcentration itself cannot accurately predict the severity of the cytotoxicity and theoverall response of populations in respect to their viability, activation and forhepatocytes, to albumin production.

Η πλούσια αιμάτωση του ήπατος της τάξης των 1500ml/min έχει σαν συνέπεια όλα τα άμορφα και έμμορφα στοιχεία του αίματος, μεταξύ των οποίων και τα περιφερικά μονοπύρηνα, να κυκλοφορούν διαρκώς μέσα στα ηπατικά κολποειδή.Η επικρατούσα άποψη σήμερα είναι ότι υπάρχει επαφή των ηπατοκυττάρων με μονοπύρηνα με κυτταροπλασματικές προσεκβολές , η οποία όμως εξαρτάται από παράγοντες που αλλάζουν τη διάμετρο των διακένων του ενδοθηλιακού φραγμού,όπως η φλεγμονή.Στόχος μας ήταν να διερευνήσουμε την αλληλεπίδραση των ηπατοκυττάρων με ομόλογα περιφερικά μονοπύρηνα σε συνθήκες invitroσυγκαλλιέργειας, όπου απουσιάζει ο ενδοθηλιακός φραγμός και οι συνθήκες είναι ελεγχόμενες. Στην αναλογία 5:1,που προσομοιάζει την φυσιολογική αναλογία επαφής των πληθυσμών in vivo, η αλληλεπίδραση των δύο πληθυσμών δεν επηρεάζει ουσιαστικά τη βιωσιμότητα ή την ενεργοποίηση τους. Στην αναλογία 1:1 όμως ,η οποία προσομοιάζει την αναλογία οξείας φλεγμονής,η επίδραση της συγκαλλιέργειας στη βιωσιμότητα και την ενεργοποίηση των πληθυσμών είναι ποσοτικά και ποιοτικά διαφορευική, γεγονός που αποδεικνύει ότι και μόνο η αλλαγή της αναλογίας επαφής αλλάζει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ τους παρά την απουσία φλεγμονώδους παράγοντα.Στη συνέχεια διερευνήσαμε το αποτέλεσμα που προκύπτει από την αλλαγήinvitro μιας ακόμα επαφής που συμβαίνει invivo: της επαφής των ηπατοκυττάρων και των μονοπύρηνων με τον παράγοντα LPS. Ο παράγοντας LPS βρίσκεται φυσιολογικά στην πυλαία φλέβα σε συγκέντρωση από 10pg/ml‐1ng/ml.Στα δικά μας πειράματα μελετήσαμε την επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων LPSαρχικά σε μονοκαλλιέργειες. Στις συνθήκες που δημιουργήσαμε παρατηρήσαμε μείωση των μέσων τιμών βιωσιμότητας και παραγωγής αλβουμίνης των ηπατοκυττάρων ήδη από τις πρώτες ώρες,και μείωση της βιωσιμότητας με ταυτόχρονη αύξηση της ενεργοποίησης των CD4+ και CD8+ κυττάρων. Η ένταση της επίδρασης τουLPSβρέθηκε ότι συνδέεται με δοσοεξαρτώμενη και χρονοεξαρτώμενη σχέση με το ύψος της συγκέντρωσης του LPS, χωρίς η σχέση αυτή να είναι γραμμική, ενώ βρέθηκε επίσης ότι η επίδραση του παράγοντα LPSείναι δυναμικό φαινόμενο που πραγματοποιείται σε διαδοχικούς χρονικά κύκλους, πιθανόν στα πλαίσια διαδοχικών κύκλων σύνδεσης‐αποσύνδεσης με τους υποδοχείς του.Η επίδραση του παράγοντα LPSως προς τη βιωσιμότητα και την ενεργοποίηση ασκείται εντονότερα στα CD4+ κύτταρα όπως φαίνεται από την στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων. Τέλος, μελετήσαμε την επίδραση του παράγοντα LPSσε συνθήκες συγκαλλιέργειας και σε αναλογία 1:1.Από τα πειράματα αυτά προέκυψε ότι η επίδραση του παράγοντα LPSήταν αντίστοιχη με αυτή στις μονοκαλλιέργειες ωστόσο ήταν εντονότερη και μεγαλύτερης διάρκειας στο χρόνο.Συμπερασματικά, η απλή αλλαγή των συνθηκών επαφής των ηπατοκυττάρων με τα μονοπύρηνα πυροδοτεί διαφορετικού βαθμού αλληλεπιδράσεις μεταξύ τους και στηρίζει την άποψη ότι τόσο τα ηπατοκύτταρα όσο και τα μονοπύρηνα αντιλαμβάνονται και αντιδρούν σε οποιαδήποτε αλλαγή συμβαίνει στο περιβάλλον τους, ακόμα και αν αυτή είναι μια αλλαγή στην αναλογία επαφής. Επίσης, η επίδραση του παράγοντα LPS στα ηπατοκύτταρα και μονοπύρηνα έχει κοινά χαρακτηριστικά, είναι όμως μοναδική για κάθε δείγμα και εξαρτάται τόσο από τα ανοσολογικά χαρακτηριστικά του δότη, όσο και από άλλους παράγοντες που δεν είναι πάντα γνωστοί και ελεγχόμενοι. Ο παράγονταςLPSδηλαδή έχει κυτταροτοξικό χαρακτήρα εν γένει για τα ηπατοκύτταρα και μονοπύρηνα, όμως η ίδια η συγκέντρωση δεν προδικάζει το βαθμό κυτταροτοξικότητας και την συμπεριφορά των πληθυσμών όσον αφορά τη βιωσιμότητά τους, την ενεργοποίησή τους και για τα ηπατοκύτταρα, την παραγωγή αλβουμίνης.