Effects of estrogens on endothelial - derived factors implicated in the atherosclerotic plaque vulnerability: clarification of the molecular mechanisms

Abstract

Introduction: Pre-menopausal women have a significantly lower risk for cardiovascular disease while postmenopausal women and women with impaired ovarian function have a greater chance of developing cardiovascular disease than premenopausal women of the same age. The time since menopause and the age at which estrogen administration has been initiated seems to be important factor to declare the protective/harmful effect of hormone replacement therapy (E2) on atherosclerosis. Among the key vessel wall components in the later stages of atherogenic process are endothelial cells (ECs). During the stages of plaque instability/rupture, metalloproteinases (MMP2 and MMP9), their inhibitors (TIMP2 and TIMP1), RANK, RANKL, OPG, MCP1, lysyl oxidase (LOX), PDGF, and ADAMTS4 play critical role. Moreover, recent studies suggest the implication of the oncosuppression gene 53 and its transcriptional target p21 in the atherogenesis process as well as in the plaque calcification through OPG regulation. Therefore in this study We aimed to investigate i) the effect of estrogens alone and in the present of low grade inflammation (2ng TNF-α) on the expression of the above molecules in ECs and ii) which type of estrogen receptor mediates these effects iii) If p21 is involved in atherosclerosis plaque formation and stability in the presence of estrogens.Methods: Human aortic endothelial cells (HAECs) were cultured, in the absence or in the presence of estradiol (E2) at various concentrations and for various incubation times without or with pre-incubation with TNFα (resembling a low grade inflammation state). The mRNA levels of all the aforementioned genes and the protein level of MCP-1, TIMP-2 and OPG were assessed by real-time PCR and Elisa respectively. The MMP-2 and MMP-9 gelatinase activity was measured by gelatin zymography assay .The experiments were repeated in either ER-α or ER-β transfected or p21 silenced HAECs.Results: HAECs did not express ER-α and ER-β while they express G-protein coupled estrogen receptor 30 (GPR30). Incubation with E2 at low concentrations induced an increase in LOX and MCP1 mRNA expression. Zymography revealed that E2 induced a down regulation of active MMP2, dose-dependently. Incubation with E2 following pretreatment with TNF-α induced a marginal increase in MMP9 and TIMP1 expression and a ten times increase in MCP1. The MMP-2 activity was also increased significantly after pre-incubation of cells with TNF-α followed by co-incubation with E2. In ERα-transfected HAECs, incubation with E2 led to up-regulation of TIMP1 and TIMP2 and a marginal increase of LOX and MCP1 mRNA levels. Moreover, E2 increased the MCP-1 and TIMP-1 protein levels and reduced the MMP-2 gelatinase activity in ER-α transfected cells. In ER-β-transfected HAECs, E2 increased the expression of LOX while decreased the expression of PDGF. The MCP-1 protein level was significantly reduced in this experimental condition. In addition, incubation of cells silenced for p21 with E2 results in reduction of MCP-1, LOX and ADAMTs-4 mRNA levels. On the contrary the mRNA level of PDGF was elevated significantly after incubation of p21 silenced cells with various concentration of E2.Conclusion: E2 induced different effects regarding atherogenic plaque instability through different ERs. The balance of expression of the various ER subtypes may play an important role in the paradoxical characterization of estrogens as both beneficial and harmful. The P21 expression it may play a crucial role in Plaque formation and stability/instability through regulation of MCP-1 and LOX, ADAMTS-4 and PDGF expression.

Εισαγωγή: Οι προ-εμμηνοπαυσιακές γυναίκες έχουν σημαντικά χαμηλότερο κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακής νόσου συγκριτικά με τις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες ή τις γυναίκες με επηρεασμένη ωοθηκική λειτουργία της ίδιας ηλικίας. Η ηλικία εμμηνόπαυσης όπως και η ηλικία έναρξης της θεραπείας υποκατάστασης με οιστραδιόλη φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στον κίνδυνο αθηροσκλήρωσης. Σε επίπεδο ιστού τα ενδοθηλιακά κύτταρα συμμετέχουν ενεργά στη δημιουργία αθηροσκλήρωσης . Στην δημιουργία της πλάκας και στην αστάθειά της σημαντικό ρόλο παίζουν οι μεταλλοπρωτεινάσες (MMP2 και MMP9), οι αναστολείς τους (TIMP2 και TIMP1), και τα μόρια RANK, RANKL, OPG, MCP1, lysyl oxidase (LOX), PDGF, και ADAMTS4. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει οτι το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53 και ο μεταγραφικός του στόχος p21 εμπλέκονται στην ασβεστοποίηση της πλάκας μέσω της ρύθμισης του OPG. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι : α) η μελέτη της επίδρασης των οιστρογόνων είτε μόνων τους είτε παρουσία παραγόντων φλεγμονής (2ng TNF-α) στην έκφραση των παραπάνω μορίων στα ενδοθηλιακά κύτταρα ii) η μελέτη των υποδοχέων μέσω των οποίων τα οιστρογόνα ασκούν αυτές τις δράσεις iii) αν το p21 εμπλέκεται στον σχηματισμό και την σταθεροποίηση της αθηρωματικής πλάκας παρουσία των οιστρογόνων. Mέθοδοι Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα της αορτής καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία οιστραδιόλης σε διάφορες συγκεντρώσεις και για διαφορετικό χρόνο επώασης παρουσία ή όχι του TNFα. Μελετήθηκαν τα επίπεδα mRNA των παραπάνω γονιδίων όπως και πρωτεΐνης των MCP-1, TIMP-2 και OPG με real-time PCR and Elisa αντίστοιχα. Η ενζυμική δραστικότητα των MMP-2 and MMP-9 μελετήθηκε με την δοκιμασία της gelatin zymography. Tα πειράματα επαναλήφθηκαν σε ER-α ή ER-β διαμολυσμένα ενδοθηλιακά κύτταρα και σε κύτταρα διαμολυσμένα με p21 siRNA. Αποτελέσματα: Τα HAECs δεν εκφράζουν τους ER-α και ER-β ενώ εκφράζουν G-protein coupled estrogen receptor 30 (GPR30). Η καλλιέργεια των κυττάρων με χαμηλές συγκεντρώσεις E2 είχε σαν αποτέλεσμα την αύξηση της έκφρασης του mRNA των γονιδίων LOX and MCP1. Η ζυμογραφία έδειξε οτι η Ε2 προκάλεσε καταστολή της MMP2 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Η επώαση με Ε2 παρουσία του TNF-α είχε σαν αποτέλεσμα την οριακή αύξηση της έκφρασης των MMP9 και TIMP1 και τον δεκαπλασιασμό της έκφρασης του MCP1 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Επιπρόσθετα, η ενεργότητα της MMP2 αυξήθηκε σημαντικά μετά την επώαση με Ε2 παρουσία του TNF-α. Σε ΕR-a διαμόλυσμένα κυττάρα, η έκθεση στην Ε2 οδήγησε σε επαγωγή της έκφρασης του mRNA των γονιδίων TIMP1 and TIMP2 και οριακή άυξηση των LOX and MCP1. Επίσης η έκθεση στην Ε2 αυτών των διαμολυσμένων κυττάρων οδήγησε σε αύξηση των πρωτεϊνικών επιπέδων των MCP-1 και TIMP-1 και σε μείωση της ενζυμικής ενεργότητας της MMP2. Η Ε2 επίσης οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων mRNA του γονιδίου LOX και σε μείωση της έκφρασης του PDGF στα ER-β-διαμολυσμένα HAECs. Τα πρωτεϊνικά επίπεδα της MCP-1 ήταν σημαντικά μειωμένα στα διαμολυσμένα ER-β κύτταρα παρουσία Ε2. Επίσης η επώαση των κυττάρων με αποσιώπηση του p21 γονιδίου, με Ε2 οδήγησε σε μείωση των επιπέδων mRNA των MCP -1, LOX και ADAMTs-4 γονιδίων. Σε αντίθεση τα mRNA επίπεδα του PDGF ήταν σημαντικά αυξημένα μετά απο επώαση αυτών των κυττάρων σε διαφορετικές συγκεντρώσεις Ε2. Συμπεράσματα: Η Ε2 είχε διαφορετικές επιδράσεις στην αστάθεια της αθηρωματικής πλάκας μέσω των υποδοχέων της. Η ισορροπία της έκφρασης των διάφορων τύπων των υποδοχέων ER μπορεί να επεξηγήσει τον παράδοξο χαρακτηρισμό των οιστρογόνων σαν ωφέλιμα και βλαβερά ταυτόχρονα. Η έκφραση του P21 μπορεί να παίξει σημαντικό ρόλο στον σχηματισμό της αθηρωματικής πλάκας μέσω της ρύθμισης της έκφρασης των MCP-1, LOX, ADAMTS-4 και PDGF γονιδίων .