Φυτοχημική ανάλυση του φυτού Indigofera hirsuta (Leguminosae) και έλεγχοι αντιοξειδωτικής δράσης και αναστολής της ALR-1, ALR-2

Abstract

The genus Indigofera (Fabaceae) is represented by 700 species of shrubs indigenous in tropical and sub-tropical regions vastly distributed in the parts of Africa, India, Thailand, China, Australia and Latin America. These plants are used in traditional medicine for the treatment of diabetes, leprosy, tuberculosis, infections, snake bite and in the management of malaria. They also exhibit hepatoprotective, anti-inflammatory and anticancer properties. Various compounds have been isolated from these species such as flavonoids, pterocarpans, rotenoids, phenolic acids and aliphatic nitro compounds. The objective of the present research on the aerial parts of Indigofera hirsuta (Fabaceae) was the determination of the chemical composition of various extracts, the evaluation of their antiradical potential by the DPPH• assay and their capacity in inhibiting the lipoxygenase enzyme through the LOX test. Further in vitro tests were conducted in order to determine the extracts ability to inhibit both the aldose reductase enzyme (ALR2) and the aldehyde reductase enzyme (ALR1). Aldose reductase enzyme of the polyol metabolic pathway is implicated in the etiology of the secondary complications of diabetes (type II). Air-dried and powdered aerial parts were exhaustively extracted with petroleum ether, dichloromethane and methanol consecutively. Evaporation under vacuum leads to a residue (27.63 g) which was dissolved in hot water and extracted with petroleum ether, diethyl ether, ethyl acetate and butanol, successively with the further collection of the aqueous extract. The qualitative analysis of the extracts obtained was conducted with the LC-DAD-MS (ESI+) system. Furthermore, isolation of the major compounds was determined by the utilization of various preparative techniques such as Column Chromatography (CC), High-Pressure Liquid Chromatography (HPLC) and Thin Layer Chromatography (TLC). Structure elucidation and clarification were obtained by the use of Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and High-Resolution MS/MS spectra. The phytochemical analysis resulted to the elucidation compounds, isolated with chromatographic techniques and analyzed by the LC-DAD-MS analysis. Isolated compounds belong to the categories of hydroxybenzoic acids, hydroxycinnamic acids, flavonoid glucosides, one indole alkaloid, a steroid, esters of triacylglycerol, carbohydrates and one cyclitol. Some of the compounds have been isolated for the first time in the genus Indigofera. Compounds determined qualitatively by means of the LC-DAD-MS (ESI+) system belong to derivatives of hydroxybenzoic acids, hydroxycinnamic acids, esters of quinic acids with hydroxycinnamic acids, flavonoid derivatives. The study of antioxidant activity resulted in the determination of the ethyl acetate extract being the one having the highest antioxidant potential according to the DPPH• assay. The study of the LOX inhibition capacity showed that the butanol extract exhibited the highest percentage of anti inflammatory inhibition activity which was 65% with the second highest percentage of inhibition activity belonging to the ethyl acetate of 58%. The study results of aldose reductase (ALR2) and aldehyde reductase (ALR1) inhibition capacity showed that all extracts were strong inhibitors of the enzymes. The extracts which showed the highest inhibition capacity of aldose reductase (ALR2) were those of ethyl acetate and diethyl ether where the inhibitory activity was ranging from 85% to 93% while the water extract exhibited also a strong capacity of inhibition. This research work is the first phytochemical study of the hexane, diethyl ether, ethyl acetate, butanol extracts, the first scientific establishment of the strong in vitro inhibitory activity against ALR2 /ALR1 enzymes of all extracts and the good in vitro anti-inflammatory activity against LOX, particularly of the butanol extract. The inhibition of ALR2 of the aerial parts of Indigofera hirsuta proved to be in accordance with the actual use of the plant for the treatment of the long term diabetic complications.

Το γένος Indigofera (Fabaceae) εκπροσωπείται από 700 είδη θάμνων, ενδημικά τροπικών και υποτροπικών περιοχών με ευρεία εξάπλωση στην κεντρική Αφρική, Ινδία, Ταϊλάνδη, Κίνα, Αυστραλία, και Λατινική Αμερική. Το είδος αυτό χρησιμοποιείται στην παραδοσιακή θεραπευτική για την αντιμετώπιση του διαβήτη, της λέπρας, της φυματίωσης, των μολύνσεων, ως αντίδοτο σε δάγκωμα φιδιού καθώς και για την θεραπεία της ελονοσίας. Επίσης διάφορα είδη του γένους αυτού επιδεικνύουν ηπατοπροστατευτική, αντιφλεγμονώδη και αντικαρκινική δράση. Διάφορα χημικά συστατικά έχουν απομονωθεί από το γένος αυτό όπως φλαβονοειδή, πτεροκαρπάνια, ροτενοειδή, φαινολικά οξέα, και αλειφατικές νιτροενώσεις. Ο σκοπός της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η απομόνωση χημικών συστατικών των διαφόρων εκχυλισμάτων, η εκτίμηση της αντιοξειδωτικής δράσης αυτών των εκχυλισμάτων με τη μέθοδο του DPPH•. Επιπλέον in vitro πειράματα διεξήχθησαν για την αποτίμηση της αντιφλεγμονώδους δράσης μέσω της αναστολής του ενζύμου της λιποξυγονάσης LOX• καθώς και την εκτίμηση της αναστολής του ενζύμου της αναγωγάσης της αλδόζης (ΑLR2) και της αναγωγάσης της αλδεΰδης (ALR1). Η αναγωγάσης της αλδόζης (ΑLR2) αποτελεί ένζυμο της οδού των πολυολών και είναι άμεσα σχετιζόμενη με την αιτιολογία των δευτερογενών επιπλοκών του διαβήτη τύπου ΙΙ. Το αποξηραμένο φυτικό υλικό εκχυλίστηκε εξαντλητικά με πετρελαϊκό αιθέρα, διχλωρομεθάνιο και μεθανόλη. Η εξάτμιση του μεθανολικού εκχυλίσματος υπό κενό, έδωσε ξηρό υπόλειμμα βάρους (27.63 g), το οποίο στη συνέχεια διαλύθηκε σε ζέον ύδωρ, ακολούθησε δε εκχύλιση διαδοχικά με διαιθυλαιθέρα, οξικό αιθυλεστέρα και βουτανόλη καθώς και συλλογή του εναπομείναντος υδατικού εκχυλίσματος. Η ποιοτική ανάλυση των εκχυλισμάτων του διαιθυλαιθέρα, του οξικού αιθυλεστέρα, της βουτανόλης και του υδατικού κλάσματος διεκπεραιώθηκε μέσω της χρήσης του συστήματος LC-DAD-MS (ESI+). Η απομόνωση των βασικών συστατικών διεξήχθη με τη χρήση τεχνικών όπως η υγρή χρωματογραφία στήλης (CC), η υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC) και η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC). H αποτίμηση της χημικής δομής επιτεύχθηκε με τη βοήθεια διαφόρων τεχνικών Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (φάσματα NMR) και HR-MS/MS. Ακολούθησε φυτοχημική ανάλυση με χρωματογραφικές τεχνικές καθώς και με την τεχνική του LC-DAD-MS. Οι απομονωμένες ενώσεις ανήκουν στις κατηγορίες των υδροξυβενζοϊκών οξέων, των υδροξυ-κινναμωμικών οξέων, των φλαβονοειδών γλυκοζιτών, ενός ινδολικού παραγώγου, ενός στεροειδούς, δύο εστέρων της τριακυλογλυκερόλης, των σακχάρων και μιας κυκλιτόλης. Μερικές από τις ενώσεις απομονώθηκαν για πρώτη φορά από το γένος Indigofera. Οι ενώσεις που διευκρινίστηκαν μέσω του συστήματος LC-DAD-MS (ESI+), ανήκουν στις κατηγορίες των υδροξυ-κινναμωμικών οξέων, των εστέρων του κινικού οξέος με υδροξυ-κινναμωμικά οξέα και των γλυκοζιτών των φλαβονοειδών. Η μελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης έδειξε ότι το εκχύλισμα που εμφάνισε την ισχυρότερη ικανότητα σάρωσης ελευθέρων ριζών ήταν το εκχύλισμα του οξικού αιθυλεστέρα, ενώ η μελέτη της ικανότητας αναστολής του ενζύμου της λιποξυγονάσης οδήγησε στο συμπέρασμα ότι το εκχύλισμα με την ισχυρότερη αντιφλεγμονώδη δράση ήταν το βουτανολικό (κοντά στο 65%), με δεύτερο το εκχύλισμα του οξικού αιθυλεστέρα που εμφάνισε 58% αναστολή. Τα αποτελέσματα από την ικανότητα αναστολής των ενζύμων της αναγωγάσης της αλδόζης και της αναγωγάσης της αλδεΰδης έδειξαν ότι τα εκχυλίσματα που εμφάνισαν την ισχυρότερη δράση ήταν του οξικού αιθυλεστέρα και του διαιθυλαιθέρα. Η προαναφερθείσα αναστολή κυμάνθηκε από 85% μέχρι 93%. Επιπροσθέτως και το υδατικό εκχύλισμα εμφάνισε ικανότητα αναστολής του ενζύμου. Η παρούσα εργασία είναι η πρώτη φυτοχημική μελέτη των εκχυλισμάτων του διαιθυλαιθέρα, του οξικού αιθυλεστέρα, του βουτανολικού εκχυλίσματος, του εκχυλίσματος του πετρελαϊκού αιθέρα και του υδατικού κλάσματος, η πρώτη in vitro μελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης των εκχυλισμάτων, η πρώτη in vitro μελέτη της αντιφλεγμονώδους δράσης με τη μέθοδο της LOX και η πρώτη in vitro μελέτη της αναστολής των ενζύμων της αναγωγάσης της αλδόζης (ΑLR2) και της αναγωγάσης της (ΑLR1).