Ανοσοϊστοχημική μελέτη της ογκογόνου πρωτεΐνης Υ-box binding protein-1 (Yb-1) σε διηθητικά καρκινώμτα μαστού

Abstract

YB-1 protein is a transcriptional - translational factor, belongs to the family of proteins that bind DNA and RNA and contains a well-conserved cold shock domain which interacts with inverted CCAAT-boxes (Y-boxes) found in the promoters of various eukaryotic genes and particularly genes related to cell growth and proliferation. YB-1 is found predominantly in the cytoplasm of cells and a small proportion can be found in the nucleus at the G1 / S phase of the cell cycle as a response to extracellular stimuli such as hyperthermia, UV irradiation and after treatment with thrombin, interferon and insulin-like growth factor 1 (IGF-1). YB - 1 is overexpressed in a variety of carcinomas (e.g. prostate, colon, ovarian, lung and bone (multiple myeloma) carcinomas, in glioblastoma) as well as in breast cancer.The purpose of this study was to investigate the expression pattern of YB - 1 protein in 225 invasive breast carcinomas. The results of this marker were statistically analyzed in order to investigate their correlation with: a) Classic clinicopathologic parameters (age, menopausal status, tumor size, histological type, histological and nuclear grade, lymph node status, stage of disease), b) Modern prognostic markers, such as the immunohistochemical expression of hormone receptors ER, PR and the oncoprotein HER-2, c) signaling molecules, such as the immunohistochemical expression of Ki-67, p53, bcl-2 proteins, d) the phenotype CD44+/CD24-/low , which is considered to represent breast cancer stem cells and e) total and disease-free patients’ survival. Based on the correlations obtained, an estimation of the possible involvement of protein YB -1 in aggressiveness and prognosis of breast cancer is made.The material consisted of 225 primary invasive breast carcinomas of which 169 were ductal and 50 lobular, derived from 225 female patients aged 25-87 years. The median follow-up for overall survival was 189 months. Sixty-five patients were presented with relapse, with a median follow-up period of 189 months. For the determination of the protein, the three step immunohistochemical method of the avidin - biotin – peroxidase complex was applied. Statistical analysis of the results and the individual correlations was performed by univariate (chi-square test and log rank test) and multivariate (Cox's hazard regression model) analysis. Results: YB-1 protein was detected in the cytoplasm and nucleus of cancer cells in 93 (41.3%) and 52 (23.10%) cases, respectively, and in stromal fibroblasts in 123 (55%) cases. The cytoplasmic expression of the protein was associated with the premenopausal state of the patients (p=0,018), with invasive ductal carcinomas (p = 0,002), positively with nuclear grade (p<0,001), inversely with the expression of ER and Bcl -2 proteins (p=0,002 and p=0,042, respectively), positively with the expression of the proteins Ki-67 and p53 (p=0,022 and p=0,002, respectively) and positively with the phenotype CD44+/CD24-/low (p=0,001). The localization of the protein in this cellular compartment was not found to exert influence on overall and disease - free patients’ survival. Nuclear expression of YB-1, while not associated with any of the prognostic markers of breast cancer or any of the novel biomarkers, was found to exert an unfavorable impact on disease - free survival: a) of all patients (p=0,05), b) of patients who received adjuvant radiotherapy or chemotherapy (p=0,036 and p=0,05, respectively), c) of patients with lobular carcinomas (p=0,006), d) of patients with carcinomas which simultaneously lacked ER and PR receptors (p=0,008), e) of patients with carcinomas positive for the expression of the receptor HER-2 (p=0,018) and f) of patients with carcinomas of the HER-2 molecular subtype [ER(-)/PR(-)/HER-2(+)] (p=0,023). The stromal expression of YB -1 was not correlated with any of the clinicopathologic parameters of breast cancer or patients’ survival. However, it was found to be positively associated with the expression of HER-2 and p53 proteins (p=0,011 and p=0,021, respectively) and inversely with the expression of the protein Bcl-2 (p=0,018). In conclusion, the results of the protein suggest that the cytoplasmic localization of YB-1 is associated with a more aggressive phenotype of breast cancer. The nuclear localization of YB-1 was correlated with a worse disease-free survival in all patients. Further, the negative correlation between nuclear YB-1 and disease-free survival of the patients who received adjuvant radiotherapy or chemotherapy, highlights the importance of the protein in the acquisition of resistance in various therapeutic regimens used for the treatment of breast cancer and thus could be considered as a possible prognostic and predictive marker.

Η πρωτεΐνη YB-1 αποτελεί έναν μεταγραφικό-μεταφραστικό παράγοντα, είναι μέλος της οικογένειας των πρωτεϊνών που δεσμεύουν DNA και RNA και περιέχει μία καλά διατηρημένη περιοχή ψυχρού σοκ που αντιδρά με ανεστραμμένα CCAAT-boxes (Y-boxes) στην περιοχή εκκινητών διαφόρων ευκαρυωτικών γονιδίων και κυρίως γονιδίων σχετιζόμενα με την αύξηση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Η ΥΒ-1 ανευρίσκεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων ενώ ένα μικρό ποσοστό μπορεί να ανευρεθεί και στον πυρήνα κατά την G1/S φάση του κυτταρικού κύκλου ύστερα από απάντηση σε εξωκυττάρια ερεθίσματα όπως η υπερθερμία, η υπεριώδης ακτινοβολία αλλά και ύστερα από χορήγηση στα κύτταρα θρομβίνης, ιντερφερόνης και ινσουλινομιμητικού παράγοντα 1 (IGF-1).Η πρωτεΐνη ΥΒ-1, υπερεκφράζεται σε καρκινώματα διαφόρων οργάνων (π.χ. του προστάτη, του παχέος εντέρου, των ωοθηκών, των πνευμόνων, των οστών (πολλαπλό μυέλωμα), στο γλοιοβλάστωμα) καθώς και στον καρκίνο του μαστού. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση του προτύπου έκφρασης της πρωτεΐνης ΥΒ-1 σε 225 διηθητικά καρκινώματα μαστού. Τα αποτελέσματα του ανωτέρω δείκτη υποβλήθηκαν σε στατιστική ανάλυση για τη διερεύνηση της σχέσης τους με α) Κλασικές κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους (ηλικία, εμμηνοπαυσιακή κατάσταση, μέγεθος όγκου, ιστολογικός τύπος, ιστολογικός και πυρηνικός βαθμός κακοηθείας, κατάσταση των επιχωρίων λεμφαδένων, στάδιο της νόσου, β) Νεότερους προγνωστικούς δείκτες, όπως ανοσοϊστοχημική έκφραση των ορμονικών υποδοχέων ER, PR και της ογκοπρωτεΐνης HER-2, γ) Σηματοδοτικά μόρια, όπως ανοσοϊστοχημική έκφραση των δεικτών Ki-67, p53, bcl-2, δ) Το φαινότυπο CD44+/CD24-/low, που θεωρείται ότι αντιπροσωπεύει τα καρκινικά αρχέγονα κύτταρα του μαστού και ε) Την ολική και ελευθέρα νόσου επιβίωση των ασθενών. Με βάση τις συσχετίσεις που προέκυψαν γίνεται εκτίμηση της πιθανής συμμετοχής της πρωτεΐνης ΥΒ-1 στην επιθετικότητα και πρόγνωση του καρκίνου του μαστού.Το υλικό αποτέλεσαν 225 πρωτοπαθή διηθητικά καρκινώματα μαστού από τα οποία 169 ήταν πορογενή και 50 λοβιακά, προερχόμενα από 225 θήλεις ασθενείς ηλικίας από 25 έως 87 έτη. Το μέσο διάστημα παρακολούθησης για την ολική επιβίωση των ασθενών ήταν 189 μήνες. Εξήντα πέντε ασθενείς εκδήλωσαν υποτροπές, με μέσο διάστημα παρακολούθησης 189 μήνες. Για τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης εφαρμόστηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος τριών βημάτων του συμπλέγματος αβιδίνης – βιοτίνης – υπεροξειδάσης. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων και των επιμέρους συσχετίσεων έγινε με μονοπαραγοντική (chi-square test και log rank test) και πολυπαραγοντική (Cox’s hazard regression model) ανάλυση.Αποτελέσματα: Η πρωτεΐνη ΥΒ-1 εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων σε 93 (41,3%) και 52 (23,10%) περιπτώσεις, αντίστοιχα, καθώς και στους στρωματικούς ινοβλάστες σε 123 (55%) περιπτώσεις. Η κυτταροπλασματική έκφραση της πρωτεΐνης συσχετίσθηκε με την προεμμηνοπαυσιακή κατάσταση των ασθενών (p=0,018), με διηθητικά πορογενή καρκινώματα (p=0,002), παράλληλα με τον πυρηνικό βαθμό κακοηθείας (p<0,001), ανάστροφα με την έκφραση των ER και της πρωτεΐνης Bcl-2 (p=0,002 και p=0,042, αντίστοιχα), παράλληλα με την έκφραση των πρωτεϊνών Ki-67 και p53 (p=0,022 και p=0,002, αντίστοιχα) και παράλληλα με το φαινότυπο CD44+/CD24-/low (p=0,001). Η εντόπιση της πρωτεΐνης σε αυτό το κυτταρικό διαμέρισμα δεν βρέθηκε να ασκεί κάποια επίδραση στην ολική και ελευθέρα-νόσου επιβίωση των ασθενών. Η πυρηνική έκφραση της ΥΒ-1, ενώ δεν συσχετίσθηκε μέ κάποιον από τους προγνωστικούς δείκτες του καρκίνου του μαστού ή κάποιον από τους νεότερους βιολογικούς δείκτες, βρέθηκε να ασκεί μη ευνοϊκή επίδραση στην ελευθέρα-νόσου επιβίωση: α) του συνόλου των ασθενών (p=0,05), β) των ασθενών που είχαν υποβληθεί σε επικουρική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία (p=0,036 και p=0,05, αντίστοιχα), γ) των ασθενών με καρκινώματα λοβιακού ιστολογικού τύπου (p=0,006), δ) των ασθενών με καρκινώματα που είχαν ταυτόχρονη απουσία των ER και PR υποδοχέων (p=0,008), ε) των ασθενών με καρκινώματα θετικά για την έκφραση του υποδοχέα HER-2 (p=0,018) και στ) των ασθενών με καρκινώματα HER-2 μοριακού υπότυπου [ER(-)/PR(-)/HER-2(+)] (p=0,023). Η στρωματική έκφραση της ΥΒ-1 δεν συσχετίσθηκε με κάποια από τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους του καρκίνου του μαστού ή την επιβίωση των ασθενών. Ωστόσο, βρέθηκε να σχετίζεται παράλληλα με την έκφραση των πρωτεϊνών HER-2 και p53 (p=0,011 και p=0,021, αντίστοιχα) και ανάστροφα με την έκφραση της πρωτεΐνης Bcl-2 (p=0,018). Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της πρωτεΐνης υποδηλώνουν ότι η κυτταροπλασματική εντόπιση της ΥΒ-1 σχετίζεται με πιο επιθετικό φαινότυπο του καρκίνου του μαστού. Η πυρηνική εντόπιση της πρωτεΐνης, συσχετίστηκε με χειρότερη ελευθέρα-νόσου επιβίωση στο σύνολο των ασθενών. Επίσης, η αρνητική συσχέτιση της πυρηνικής ΥΒ-1 με την ελευθέρα-νόσου επιβίωση των ασθενών που είχαν λάβει επικουρική ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία, αναδεικνύει τη σημασία της στην απόκτηση αντίστασης σε διάφορα θεραπευτικά σχήματα που χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού και την καθιστά ως ένα πιθανό προγνωστικό-προβλεπτικό δείκτη.