Μοριακή μελέτη της κατανομής των ανοσοσφαιρινών σε ασθενείς με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο

Abstract

OBJECTIVE: Despite extensive studies of B-cells in systemic lupuserythematosus (SLE), primary versus secondary abnormalities and theircontributions in disease pathogenesis remain to be clarified. The present studieswere conducted to further explore the possibility that there are primaryabnormalities in the formation of the immunoglobulin heavy-chain (Ig-VH/DH/JH) repertoire in patients with active SLE. Such abnormalities could bebetter revealed by comparative analysis of the regenerating repertoire aftertherapeutic administration of rituximab, an anti-CD20 antibody which causestransient but complete B-cell depletion. Moreover, whether the regenerating Bcellrepertoire in SLE is diverse and polyclonal is not known. Therefore, wecharacterised the peripheral Ig-VH/DH/JH repertoire in patients with active lupusnephritis and compared it to the repertoire of healthy individuals. We alsoexamined how B-cell depletion might affect repertoire composition at an earlytime-point of B-cell regeneration in relation to clinical disease activity and autoantibody status.METHODS: Ig-VH/DH/JH genes were amplified from genomic DNA ofperipheral B cells by nested PCR using family-specific primers. PCR productswere cloned into pRSET vector and insert-containing plasmids were sequenced.RESULTS: Analysis of 1246 Ig-VH/DH/JH sequences showed that, in contrastto the 4 healthy controls, in all 7 patients with active SLE, clusters of clonalyrelatedIg-VH/DH/JH sequences were evident. In addition to original somaticmutation(s) shared in the majority of clonaly-related sequences, ongoingmutation suggested expansion of single B-cell precursors and clonal evolution.Otherwise, lupus repertoire (VH/DH/JH gene family usage and CDR3 regioncharacteristics) was similar to that of healthy subjects with the exception ofincreased somatic hypermutation. In 3 patients re-examined after rituximab (1st total remission, 2nd partial remission, 3rd active disease/therapeutic failure), theregenerating repertoire (369 sequences) was diverse and comparable tobaseline, albeit with fewer somatic mutations but more clonal expansions. Thiswas evident regardless of disease activity status and despite disapearence ofdetectable autoantibodies, indicating a persistent repertoire dysregulation inlupus. Based on a multinomial distribution model for assessment of antigenselection, only 25% of B-cell clonal expansions appeared to be due to antigenselection.CONCLUSION: This study is the first to provide evidence that clonalexpansion of B-cells, which is partly due to (auto)antigen pressure and does notseem to be related to disease activity, is common in SLE. Clonal expansioncould be considered as an intrinsic sign of immune dysregulation which maylead to a preferential survival/growth of potentially autoreactive B-cells clonesand contribute to SLE pathogenesis.

ΣΚΟΠΟΣ: Παρά τις εκτεταμένες μελέτες δεν είναι γνωστό εάν οι ποικίλες μη-φυσιολογικές λειτουργίες των Β κυττάρων που παρατηρούνται σε ασθενείς με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο (ΣΕΛ) είναι δευτεροπαθείς ή πρωτογενώς συμβάλλουν στην παθογένεια της νόσου. Η στοχευμένη θεραπεία της παροδικής εξάλειψης των Β κυττάρων μπορεί να είναι ωφέλιμη σε ασθενείς με ενεργό υπερπλαστική νεφρίτιδα ΣΕΛ. Συγκριτικές μελέτες προ- και μετά παροδική εξάλειψη δίνουν την ευκαιρία να διερευνηθεί ο παθογενετικός ρόλος των Β κυττάρων. Σκοπός μας ήταν η μελέτη της σύνθεσης του ρεπερτορίου των βαριών αλυσίδων των ανοσοσφαιρινών (Ig-VH/DH/JH) των Β κυττάρων και η ανεύρεση ενδεχόμενων αλλαγών σε πρώϊμη φάση της αναγέννησης μετά χορήγηση Rituximab (anti-CD20 αντίσωμα), καθώς και εάν οι αλλαγέςσυνδέονται με ενεργότητα νόσου.ΥΛΙΚΟ-ΜΕΘΟΔΟΙ: Μελετήθηκαν 7 ασθενείς με ενεργό υπερπλαστική νεφρίτιδα ΣΕΛ οι οποίοι έλαβαν ως θεραπεία Rituximab, παράλληλα με 4 υγιή άτομα που χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Σε 3 ασθενείς έγιναν επιπλέον μελέτες στο χρονικό σημείο του 33-35% της ανάκτησης των Β κυττάρων σε σχέση με το ποσοστό τους πριν τη θεραπεία. Η μελέτη έγινε σε γενωμικό DNA, που αποκτήθηκε από περιφερικό αίμα, με τη μέθοδο ενίσχυσης και κλωνοποίησης των ανασυνδυασμένων γονιδίων Ig-VH/DH/JH.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Ανάλυση 1246 Ig-VH/DH/JH αλληλουχιών έδειξε ότι, σε αντίθεση με τους 4 υγιείς μάρτυρες, και στους 7 ασθενείς που εξετάσθηκαν στη φάση ενεργού νεφρίτιδος εντοπίσθηκαν ομάδες κλωνικά σχετιζόμενων αλληλουχιών. Επιπλέον, διαπιστώθηκαν υπερμεταλλάξεις στη VH DNAαλληλουχία ενδεικτικές της ύπαρξης κλωνικής εξέλιξης/διαφοροποίησης συγκεκριμμένων Β κυττάρων. Ανάλυση του ρεπερτορίου (χρησιμοποιούμενα γονίδια VH/DH/JH, CDR3 περιοχή) τόσο στους ασθενείς, όσο και στους μάρτυρες δεν έδειξε διαφορές. Αν και το ποσοστό των υπερμεταλλαγμένων DNA αλληλουχιών δεν διέφερε μεταξύ ΣΕΛ και μαρτύρων, οι ασθενείς είχαν περισσότερες υπερμεταλλάξεις/VH αλληλουχία. Σε 3 ασθενείς που εξετάσθηκαν μετά Rituximab (1ος πλήρη ύφεση, 2ος μερική ύφεση, 3ος ενεργό νόσο/θεραπευτική αποτυχία) το «νέο» ρεπερτόριο των Β κυττάρων ήταν συγκρίσιμο με αυτό των μαρτύρων, αλλα περιείχε περισσότερες ολιγοκλωνικές εκπτύξεις. Το φαινόμενο ήταν ανεξάρτητο από την κλινική ενεργότητα της νόσου και από την εξαφάνιση των αυτοαντισωμάτων, υποδεικνύοντας εμμένουσα ανωμαλία του ρεπερτορίου των Β κυττάρων σε ΣΕΛ. Περαιτέρω ανάλυση με πολυνομιακό στατιστικό πρότυπο για την εντόπιση αντιγονικής επιλογής, έδειξε ότι μόνο 25% των ολιγοκλωνικών εκπτύξεων προήλθαν από επιλογή. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Η παροδική εξάλειψη των Β κυττάρων από το Rituximab,διατηρεί στο «νέο» Ig-VH/DH/JH ρεπερτόριο την αναμενόμενη ετερογένεια, ωστόσο οι ολιγοκλωνικές εκπτύξεις δεν διορθώνονται. Η ανωμαλία αυτή, που περιγράφεται για πρώτη φορά, φαίνεται ότι είναι πρωτογενής και μπορεί να συμβάλλει στην παθογένεια της νόσου προσφέροντας ιδιαίτερο πλεονέκτημα επιβίωσης/πολλαπλασιασμού σε συγκεκριμμένα Β κύτταρα που ήδη έχουν,ή/και δυνατόν να αποκτούν αυτοδραστικές ιδιότητες.