Προσδιορισμός γονοτύπου HPV ιού ατο δέρμα των παιδιών με τη μοριακή τεχνική άμεσης ανάλυσης αλληλουχιών DNA (direct sequencing analysis): συσχέτιση γονοτύπου με την κλινική προσβολή, τον τρόπο μετάδοσης και την ηλικία

Abstract

Human Papilloma viruses (HPV) are small double stranded DNA viruses that comprise a family of more than 150 types. HPVs can be classified into mucosal and cutaneous types. Mucosal types infect the mucous membrane and can cause cervical neoplasia in adults as well as anogenital warts in both children and adults. Cutaneous types infect the squamous epithelium of the skin and produce common warts, plantar warts and flat warts, which occur commonly on the hands, face and feet. Skin warts are estimated to occur with a greatest incidence between 12 and 16 years of age and are usually more frequent in girls than in boys. The natural progression of the skin warts in childhood indicates that warts spontaneously clear after 2 years without treatment in 40% of children. Depending on their location warts can be painful and in that case treatment is necessary.The aim of this study is to determine the presence of HPV in warts in children in order to associate the virus and the disease. Eighty-four children of clinically diagnosed cutaneous warts were recruited. The age of our study population ranged between 1 and 18 years. The participation in the study included a personal history of the subjects which gave information regarding the health history of a skin disease, personal habits, clinical findings and the actual type and location of warts. Parents gave an informed consent for the study.We studied skin biopsy specimens. DNA was extracted using a commercial kit. In order to distinguish the different HPV types we used specific pair of primers in order to amplify the HPV DNA. PCR amplification of the L1 region was followed by1.Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis2.Sequencing followed by Blast analysisIn some cases due to multiple infection or unknown restriction enzyme pattern we were not able to detect the HPV type. In those cases but also in the majority of our samples we developed a novel multiplex human papilloma virus bead based genotyping assay. Biotinylated PCR products were hybridized to type specific oligonucleotide probes coupled to beads and analyzed using Luminex technology.The genotype results but also the clinical characteristics of our samples were statistically analyzed using SPSS in order to determine the relation of the HPV type with environmental risk factors for warts.Common warts represent the type with the highest prevalence among children in our study and were present in higher frequency on the exposed parts of the body. In addition we used a variety of methods for HPV typing and it seems that the newly introduced Luminex assay maximized the discrimination of genotypes even in the case of multiple HPV infections. However the utility of the RFLP methods and sequencing is also of great importance. Last but not least the results of our study seem to be in concordance with the literature on warts published thus far. HPV 57 is the predominant type in our study. However the detection of the high risk HPV type 16 in 33% of our positive samples indicates the presence of mucosal high risk HPV types in skin of children. It will require large cross sectional studies and long term follow up to confirm the association of different HPV types and warts in children.

Ο ανθρώπινος ιός των θηλωμάτων (Human Papilloma Virus, HPV) είναι ένας DNA ιός που προσβάλλει τα κύτταρα της βασικής στιβάδας της επιδερμίδας και τα επιθηλιακά κύτταρα. Το γονιδίωμά του ενσωματώνεται στο γονιδίωμα αυτών των κυττάρων και τα εκτρέπει σε πολλαπλασιασμό. Έχουν ταυτοποιηθεί μέχρι σήμερα περισσότεροι από 150 γονότυποι του HPV ιού. Ορισμένοι έχουν ιδιαίτερη σημασία διότι προκαλούν βλάβες που μπορεί να καταλήξουν σε καρκίνο. Ο ιός του θηλώματος του ανθρώπου HPV στην παιδική ηλικία έχει ενοχοποιηθεί για μια σειρά από καλοήθεις αλλοιώσεις σε διάφορες ανατομικές θέσεις, με συχνότερη εκδήλωση τα θηλώματα του δέρματος. Η κλινική βλάβη που προκαλεί ο ανθρώπινος ιός των θηλωμάτων στο δέρμα ονομάζεται μυρμηκιά. Ανάλογα με την κλινική τους εικόνα ή την εντόπισή τους, οι μυρμηκιές διακρίνονται σε κοινές, νηματοειδείς, ομαλές, περιονυχικές, υπονυχικές, παλαμών και πελμάτων. Η επίπτωσή τους είναι μεγαλύτερη στις ηλικίες 12 έως 16 έτη και στα κορίτσια σε σχέση με τα αγόρια. Στο 40% των παιδιών τα δερματικά θηλώματα υποχωρούν χωρίς θεραπεία. Σε ορισμένες περιπτώσεις λόγω της ανατομικής τους θέσης μπορούν να προκαλέσουν πόνο στο παιδί, γεγονός που απαιτεί τη θεραπευτική τους αντιμετώπιση.Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί η τυχόν παρουσία του ιού HPV σε δείγματα μυρμηκιάς σε παιδιά, ώστε να συσχετιστεί η παρουσία του ιού με τη νόσο. Στη μελέτη συμμετείχαν 84 παιδιά ηλικίας έως 18 ετών με διαγνωσμένες μυρμηκιές. Η συμμετοχή στη μελέτη περιλάμβανε τη συμπλήρωση ερωτηματολογίου που περιείχε πληροφορίες σχετικές με οικογενειακό και ατομικό ιστορικό. Όσον αφορά το ερωτηματολόγιο ατομικού ιστορικού περιείχε πληροφορίες για το ιστορικό υγείας δερματικού νοσήματος, τις ατομικές συνήθειες (κολυμβητήριο, γυμναστήριο), τα κλινικά ευρήματα και τον τύπο της βλάβης. Το ερωτηματολόγιο του οικογενειακού ιστορικού αφορούσε την καταγραφή δερματικών νοσημάτων στην οικογένεια. Με την έγγραφη συγκατάθεση των γονιών των παιδιών που συμμετείχαν στη μελέτη συλλέχθηκε ξέσμα από την περιοχή της βλάβης από το οποίο απομονώθηκε γενετικό υλικό του ιού HPV προκειμένου να γίνει η ταυτοποίηση.Για να προσδιοριστεί ο τύπος του ιού του HPV στα δείγματα μυρμηκιάς χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές μεθοδολογίες σε συνδυασμό και προς επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων. Αρχικά πολλαπλασιάστηκε το DNA του ιού με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Στη συνέχεια το προϊόν της αντίδρασης υπέστη :a)Κατάτμηση με περιοριστικές ενδονουκλεάσες (πέψη) με την οποία συγκεκριμένος τύπος HPV δημιουργεί στο πήκτωμα αγαρόζης συγκεκριμένο πρότυπο ζωνών.b)Αλληλούχιση της πρωτοδιάταξης DNA (Sequencing) όπου με τη βοήθεια του λογισμικού BLAST τυποποιήθηκε ο τύπος του ιού.Ωστόσο σε κάποιες περιπτώσεις λόγω πολλαπλής λοίμωξης ή μη γνωστού προτύπου ζωνών για το πήκτωμα δεν ήταν δυνατός ο προσδιορισμός του τύπου. Σε αυτές τις περιπτώσεις αλλά και για το μεγαλύτερο μέρος των δειγμάτων έγινε ειδικός σχεδιασμός μικροσφαιριδίων για την ανάλυση με την τεχνολογία Luminex. Μετά τον προσδιορισμό των τύπων του ιού του HPV που ανιχνεύθηκαν στα υπό εξέταση δείγματα, πραγματοποιήθηκε στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων με το πρόγραμμα SPSS. Αυτό είχε ως στόχο τη συσχέτιση της συχνότητας εμφάνισης, του τύπου του HPV με τα δεδομένα που συλλέχθησαν από τα ερωτηματολόγια (ηλικία, ιστορικό μόλυνσης, συνήθειες κτλ.). Από τις παραπάνω συσχετίσεις φάνηκε ότι ο επικρατέστερος τύπος μυρμηκιάς στα παιδιά είναι οι κοινές και οι παλαμών-πελμάτων, ενώ εμφανίζονται σε μεγαλύτερα ποσοστά στις επιφάνειες του σώματος που έρχονται σε επαφή με το εξωτερικό περιβάλλον. Επιπλέον έγινε μια συγκριτική μελέτη των μεθόδων που χρησιμοποιήθηκαν για την τυποποίηση του ιού. Από τη σύγκριση αυτή προέκυψε ότι η μέθοδος Luminex υπερισχύει σε σχέση με τη μέθοδο πέψης με περιοριστικές ενδονουκλεάσες, ενώ η μέθοδος ανάλυσης της αλληλουχίας (sequencing) παραμένει η μέθοδος επιβεβαίωσης του αποτελέσματος.Τέλος τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης συσχετίστηκαν με δεδομένα από την υπάρχουσα βιβλιογραφία προκειμένου να διερευνηθεί αν υπάρχει ομοιογένεια με παρόμοιες μελέτες. Έτσι τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης συμβαδίζουν με αυτά της διεθνούς βιβλιογραφίας όσον αφορά τους συχνότερους τύπους HPV (HPV 57) που ανιχνεύονται στο γενικό πληθυσμό στις μυρμηκιές. Η ανεύρεση του τύπου HPV 16 στις κοινές μυρμηκιές, σε ποσοστό 33%, είναι εύρημα ιδιαίτερης σημασίας δεδομένου ότι ο τύπος αυτός απαντά σε λοιμώξεις και νεοπλασίες του δέρματος και των βλεννογόνων της περιγεννητικής και της περιπρωκτικής περιοχής. Μελλοντικές έρευνες σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων μυρμηκιάς θα οδηγήσουν σε καλύτερη κατανόηση της δράσης και του τρόπου αντιμετώπισης του ιού HPV.