Βιοτεχνολογική αξιοποίηση μικροβιακού και ενζυμικού συστήματος λιγνινολυτικών μυκήτων

Abstract

The main aim of the present doctoral thesis was the investigation of the biotechnological potential of the ligninolytic fungi, at the whole-cell level as well as at the level of the enzymatic systems responsible for the oxidative degradation of lignocellulosic biomass. Towards that goal, in the first steps of the thesis, two basidiomycetes strains were tested regarding their ability to degrade waste materials of high phenolic content. The waste material chosen for this purpose was the olive oil mill wastewater (OMWW) a product that poses serious problems for olive-oil producing countries due to its high organic load and its high concentration of phenol compounds. The basidiomycetes strains Pleurotus citrinopileatus LGAM 28684 and Irpex lacteus LGAM 238 were tested regarding their ability to degrade OMWW, while the effect of several parameters, such as the pH and the nature and concentration of the nitrogen supplementation, in the degradation capacity was also investigated. The optimum conditions for each strain were found to be pH 6, 30 g L-1 corn steep liquor for P. citrinopileatus and 20 g L-1 for I. lacteus. The two strains showed very satisfactory levels of OMWW degradation and extracellular ligninolytic enzymes production, achieving over 90% phenols reduction and decolourization. In the next step, the ability of intracellular and extracellular polysaccharides production from three basidiomycetes strains was tested in submerged culture, and the simultaneous degradation and valorization of the OMWW was attempted through the production of fungal polysaccharides. The basidiomycetes strains selected for this purpose were Ganoderma lucidum LGAM 9720, Pleurotus citrinopileatus LGAM 28684 and Pleurotus ostreatus LGAM 1123, and they were grown in two different media for comparison, a semi-synthetic medium with xylose as carbon source and an OMWW-based medium, while two different methods were tested for the isolation of the biomass polysaccharides. The highest levels of OMWW degradation were observed from G. lucidum, while the extracellular polysaccharides isolated from all strains were found to be richer in glucan content in the case of semi-synthetic medium growth compared to OMWW-growth. Regarding the intracellular polysaccharides, the P. ostreatus biomass was found to be richer in glucans, with total glucan content 8.68% (w/w) during growth in semi-synthetic medium and 7.58% (w/w) during growth in OMWW- based medium. After application of the two isolation methods in the mycelial biomass, the fraction with the highest glucan content was found to be the one from G. lucidum after growth in semi-synthetic medium, containing 49.1% (w/w) total glucans. The FTIR spectra of the isolated fractions revealed the existence of α- and β- glucosidic bonds, but also the existence of protein contamination, indicating that the removal of α-glucans and proteins was not entirely successful with neither of the two tested methods. However, the results of the present thesis indicate that the simultaneous degradation and valorization of OMWW for the production of microbial polysaccharides could be a viable alternative for the treatment of such wastes. Following the above results, regarding the study and valorization of the enzymatic potential of ligninolytic fungi, two genes were selected from the thermophile ascomycete Myceliophthora thermophila, on the basis of bioinformatics analysis indicating their implication in lignocellulose degradation, and thus were considered appropriate for further study. These genes were isolated form the genome of M. thermophila, cloned in suitable vectors and expressed heterologously in Pichia pastoris. The resulting enzymes were found to exhibit peroxidase and polyphenol-oxidase activities and were named MtPerII and MtLac2 respectively. Following their separation and purification with metal affinity chromatography, the purified enzymes were fully characterized in regard to their physicochemical, biochemical and catalytic properties. The MtPerII and MtLac2 were found to be able to oxidize a wide variety of phenolic compounds, while they were found to be very thermostable, since MtPerII was found to retain 70% of its activity in 50 oC after 8-hour incubation, while MtLac2 retains 70% of its activity in 50 oC after 24-hour incubation. Moreover, MtPerII was appears to be extremely tolerant in excessive H2O2 quantities, since it retains 80% of its original activity after 24-hour incubation in great H2O2 excess. Regarding their biochemical characteristics, MtPerII displays the optimum activity at pH 5 and 60 oC, while MtLac2 in pH 4 and 50 oC. Due to their high degree of glycosylation, both enzymes appear to be of a higher molecular weight than the theoretically calculated. The performance of each enzyme was tested in an application relative to biocatalysis field, with great success: MtPerII was found to be able to successfully catalyze catechol polymerization, while with the use of MtLac2 the bioconversion of flavonoid compounds was achieved, from the natural chalcone butein to natural aurone sulfuretin, a product with multiple biological activities. Finally, the commercial laccase from M. thermophila was used for the bioconversion of phenolic compounds, specifically catechol, purogallol and gallic acid. The products obtained from the oxidation of catechol and gallic acid were found to be polymers, which were further characterized regarding their optical and thermal properties. 1H-NMR and FTIR spectrometry revealed the bonds among the monomer units were ether and carbon-carbon bonds, while the molecular weight of polycatechol was found higher than the respective molecular weight of poly-gallic acid. However, the bioconversion product of pyrogallol was found to be its dimer, purpurogallin, a molecule with very high antioxidant activity. Overall, the biocatalytic synthesis of phenol poly- or oligomers, as demonstrated in the present work, could be used as an alternative, environmentally friendly solution in traditional synthetic chemistry applications.

Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση του βιοτεχνολογικού δυναμικού λιγνινολυτικών μυκήτων, τόσο σε επίπεδο ολόκληρων των οργανισμών και των καλλιεργειών τους, όσο και των επιμέρους ενζυμικών συστημάτων που είναι υπεύθυνα για την οξειδωτική διάσπαση της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας. Προς αυτή την κατεύθυνση, στα πρώτα στάδια της διατριβής δοκιμάστηκαν δυο στελέχη βασιδιομυκήτων αναφορικά με την ικανότητά τους να αποικοδομούν απόβλητα υψηλού φαινολικού φορτίου. Το απόβλητο που επιλέχθηκε προς διερεύνηση ήταν το υγρό απόβλητο ελαιουργείου (ΥΑΕ), το οποίο αποτελεί σημαντικό πρόβλημα στις χώρες παραγωγής ελαιολάδου, λόγω του υψηλού του οργανικού φορτίου και της υψηλής συγκέντρωσης φαινολικών ενώσεων. Τα στελέχη βασιδιομυκήτων Pleurotus citrinopileatus LGAM 28684 και Irpex lacteus LGAM 238 δοκιμάστηκαν ως προς την ικανότητά τους να αποικοδομούν το ΥΑΕ, ενώ διερευνήθηκε και η επίδραση διαφόρων παραμέτρων στην ικανότητα αποικοδόμησης, όπως το pH του μέσου καλλιέργειας, η προσθήκη πηγών αζώτου και η συγκέντρωσή τους. Οι συνθήκες που κρίθηκαν βέλτιστες για κάθε στέλεχος ήταν οι pH 6, 30 g L-1 εκχύλισμα επεξεργασίας σπόρων καλαμποκιού για το P. citrinopileatus και 20 g L-1 για το I. lacteus. Τα δύο στελέχη έδειξαν πολύ ικανοποιητικά επίπεδα αποικοδόμησης του ΥΑΕ και παραγωγής εξωκυτταρικών λιγνινολυτικών ενζύμων, επιτυγχάνοντας πάνω από 90% μείωση των φαινολικών ενώσεων και αποχρωματισμού. Σε επόμενο στάδιο δοκιμάστηκε η ικανότητα παραγωγής ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών πολυσακχαριτών από ανάπτυξη τριών στελεχών βασιδιομυκήτων σε βυθισμένη καλλιέργεια, και επιχειρήθηκε η ταυτόχρονη αποικοδόμηση και αξιοποίηση του ΥΑΕ μέσω της παραγωγής μυκηλιακών πολυσακχαριτών. Τα στελέχη βασιδιομυκήτων που επιλέχθηκαν για αυτό το σκοπό ήταν τα Ganoderma lucidum LGAM 9720, Pleurotus citrinopileatus LGAM 28684 και Pleurotus ostreatus LGAM 1123, και αναπτύχθηκαν για συγκριτικούς σκοπούς σε δύο θρεπτικά υποστρώματα, ένα ημισυνθετικό μέσο με ξυλόζη ως πηγή άνθρακα και ένα μέσο με ΥΑΕ ως πηγή άνθρακα, ενώ δοκιμάστηκαν επίσης και δύο διαφορετικές μέθοδοι απομόνωσης των ενδοκυτταρικών πολυσακχαριτών της βιομάζας. Τα υψηλότερα επίπεδα αποικοδόμησης του ΥΑΕ παρατηρήθηκαν από το στέλεχος G. lucidum, ενώ οι εξωκυτταρικοί πολυσακχαρίτες που απομονώθηκαν από όλα τα στελέχη βρέθηκαν να είναι πιο πλούσιοι σε γλυκάνες στην περίπτωση της ανάπτυξης σε ημισυνθετικό υπόστρωμα σε σύγκριση με το θρεπτικό μέσο με ΥΑΕ. Σχετικά με τους ενδοκυτταρικούς πολυσακχαρίτες, η βιομάζα του P. ostreatus βρέθηκε να είναι η πιο πλούσια σε γλυκάνες, με ολικό περιεχόμενο 8,68 % (w/w) κατά την ανάπτυξη σε ημισυνθετικό μέσο και 7,58% (w/w) κατά την ανάπτυξη σε ΥΑΕ. Μετά την εφαρμογή των μεθόδων απομόνωσης των πολυσακχαριτών της βιομάζας, το κλάσμα με την υψηλότερη περιεκτικότητα σε γλυκάνες προήλθε από το G. lucidum μετά από ανάπτυξη σε ημισυνθετικό μέσο, με 49,1 % (w/w) ολικές γλυκάνες. Τα φάσματα FTIR των απομονωμένων κλασμάτων αποκάλυψαν την ύπαρξη α- και β- γλυκοζιδικών δεσμών, αλλά και την ύπαρξη πρωτεϊνικών επιμολύνσεων, γεγονός που υποδηλώνει ότι η απομάκρυνση των α-γλυκανών και των υπολειπόμενων πρωτεϊνών δεν επιτεύχθηκε πλήρως με καμία από τις δύο μεθόδους. Ωστόσο, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής υποδεικνύουν ότι η ταυτόχρονη αποικοδόμηση και αξιοποίηση των ΥΑΕ για παραγωγή μικροβιακών πολυσακχαριτών θα μπορούσε να είναι μια βιώσιμη λύση για την επεξεργασία τέτοιου είδους αποβλήτων. Ακολούθως, σχετικά με τη μελέτη και αξιοποίηση του ενζυμικού δυναμικού των λιγνινολυτικών μυκήτων, επιλέχθηκαν δύο γονίδια του θερμόφιλου ασκομύκητα Myceliophthora thermophila τα οποία μετά από βιοπληροφορική ανάλυση βρέθηκε ότι πιθανώς εμπλέκονται στην αποικοδόμηση της λιγνινοκυτταρίνης και άρα κρίθηκαν κατάλληλα για περαιτέρω μελέτη. Τα γονίδια αυτά απομονώθηκαν από το γονιδίωμα του μικροοργανισμού, κλωνοποιήθηκαν σε κατάλληλους φορείς και εκφράστηκαν ετερόλογα στη ζύμη Pichia pastoris. Τα ένζυμα που προέκυψαν βρέθηκε ότι είχαν ενεργότητες υπεροξειδάσης και πολυφαινολικής οξειδάσης και ονομάστηκαν αντίστοιχα MtPerII και MtLac2. Μετά την απομόνωση των ενζύμων αυτών με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου μετάλλου, τα καθαρά πλέον ένζυμα χαρακτηρίστηκαν πλήρως ως προς τις φυσικοχημικές, βιοχημικές και καταλυτικές ιδιότητές τους. Οι MtPerII και MtLac2 βρέθηκε ότι μπορούν να οξειδώσουν μεγάλο εύρος φαινολικών υποστρωμάτων, ενώ κρίθηκαν ιδιαίτερα θερμοσταθερά ένζυμα, αφού η μεν MtPerII φάνηκε ότι διατηρεί το 70% της ενεργότητάς της στους 50oC μετά από επώαση 8 ωρών, ενώ η MtLac2 αντίστοιχα διατηρεί το 70% της ενεργότητάς της μετά από επώαση 24 ωρών στους 50 oC. Επιπλέον, η MtPerII φάνηκε ότι διαθέτει μια ασυνήθιστα υψηλή ανθεκτικότητα σε υψηλές συγκεντρώσεις H2O2, αφού διατηρεί το 80% της αρχικής της ενεργότητας μετά από επώαση 24 ωρών σε μεγάλη περίσσεια H2O2. Σε ότι αφορά τα βιοχημικά τους χαρακτηριστικά, η μεν MtPerII δρα βέλτιστα σε συνθήκες pH 5 και 60 oC, ενώ η MtLac2 σε pH 4 και 50 oC. Εξαιτίας του υψηλού βαθμού γλυκοζυλίωσής τους, τα ένζυμα αυτά εμφανίζουν υψηλότερα μοριακά βάρη από τα θεωρητικά αναμενόμενα. Στη συνέχεια, καθένα από τα ένζυμα αυτά δοκιμάστηκε σε μια εφαρμογή που σχετίζεται με το πεδίο της βιοκατάλυσης, με ιδιαίτερη επιτυχία: Η MtPerII βρέθηκε ότι μπορεί να καταλύσει επιτυχώς τον πολυμερισμό της κατεχόλης, ενώ με τη χρήση της MtLac2 επιτεύχθηκε η βιομετατροπή φλαβονοειδών ενώσεων, από τη φυσική χαλκόνη βουτεΐνη στη φυσική ωρόνη σουλφουρετίνη, ένα προϊόν με πολλές βιολογικές δράσεις. Τέλος, η εμπορική λακκάση του M. thermophila χρησιμοποιήθηκε για τη βιομετατροπή φαινολικών ενώσεων, και συγκεκριμένα της κατεχόλης, της πυρογαλλόλης και του γαλλικού οξέος. Τα προϊόντα που προέκυψαν από την οξείδωση της κατεχόλης και του γαλλικού οξέος βρέθηκε ότι ήταν πολυμερή μόρια, τα οποίο χαρακτηρίστηκαν ως προς τις οπτικές και θερμικές ιδιότητές τους. Οι φασματοσκοπίες 1H-NMR και FTIR αποκάλυψαν ότι οι δεσμοί που δημιουργήθηκαν μεταξύ των μονομερών ήταν αιθερικοί και δεσμοί άνθρακα-άνθρακα, ενώ το μοριακό βάρος της πολυκατεχόλης βρέθηκε μεγαλύτερο από αυτό του πολύ-γαλλικού οξέος. Ωστόσο, το προϊόν βιομετατροπής της πυρογαλλόλης βρέθηκε να είναι το διμερές της, η πουρπουρογαλλίνη, ένα μόριο με πολύ υψηλή αντιοξειδωτική ικανότητα. Γενικά, η βιοκαταλυτική σύνθεση των φαινολικών πολύ- ή ολιγομερών όπως επιτεύχθηκε στην παρούσα διδακτορική διατριβή θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σαν μια εναλλακτική, πιο φιλική προς το περιβάλλον λύση σε παραδοσιακές εφαρμογές συνθετικής χημείας.