Εμβρυϊκή και νεογνική νευροτοξικότητα και ηπατοτοξικότητα της αιθανόλης και της ελλιπούς σε θειαμίνη διατροφής: πειραματική μελέτη επί επιμύων

Abstract

Background: As it is known, the activities of brain enzymes, acetylcholinesterase (AChE) and two adenosine triphosphatases (Na+, K+-ATPase and Mg2+-ATPase) are critical parameters for the assessment of cholinergic function, the synaptic excitability and the control of protein synthesis rate and cell growth, respectively. The activities of these enzymes are subject to variations from the action of free radicals and vary considerably between different brain regions during the experimental induction of metabolic disorders that affect (among others), and the CNS. The purpose of this study is: i) to investigate the effects of mild in vivo exposure to ethanol (EtOH) (10% v/v in drinking water) in pregnant rats, on the activities of AChE, (Na+, K+)-ATPase and Mg2+-ATPase in whole brain and brain region (frontal cortex, hippocampus, hypothalamus, and cerebellum) homogenates of both newborn and 21-day-old offspring rats, during gestation, and throughout the duration of both gestation and lactation, and ii) to investigate the effects of mild in vivo administration of EtOH and/or thiamine deficient diet (TDD) to pregnant rats during gestation, on the activities of the aforementioned enzymes in whole brain homogenates, in addition to the liver histopathological examination, of both newborn and 21-day-old offspring rats.Materials and Methods: For the in vivo experiments of the present study (two different experiments were performed), female and male adult AlbinoWistar were used. Food and water were provided ad libitum. In the 1st experimental phase, each male rat was placed with two female rats in each case, in order mating to be achieved. Following that (as assessed through the examination for the presence of an ejaculatory plug in the vagina), males were removed and females were divided into three groups: (i) Control (receiving tap water during both gestation and lactation), (ii) EtOH(G) (receiving 10% v/v of EtOH in the drinking water during gestation), and (iii) EtOH(G+L) (receiving 10% v/v of EtOH in the drinking water during gestation and lactation). At the end of lactation period, the 21-day-old rat offsprings were weighted, sacrificed by decapitation and their brains were rapidly removed, providing tissue samples for the corresponding subgroups Control, EtOH(G) and EtOH(G+L). Apart from those whole brains, other offspring rats were used in order for the following brain regions to be isolated and pooled into amounts sufficient for the undertaking of the below-mentioned neurochemical determinations in their homogenates: frontal cortex, hippocampus, hypothalamus, cerebellum and pons. In the 2nd experimental phase, after mating confirmed (same way as described acove), males were removed and females were divided into four groups: (i) Control (receiving tap water and normal diet during both gestation and lactation), (ii) EtOH (receiving normal diet and 10% v/v of EtOH in the drinking water during gestation), (iii) TDD (receiving special T deficient diet and tap water during gestation), and iv) TDD+EtOH (receiving 10% v/v of EtOH in the drinking water and special thiamine deficient diet during gestation). At birth, sufficient amount of newborn rats from each group were weighted, sacrificed by decapitation and their brains were rapidly removed, providing tissue samples for the Control1, EtOH1, TDD1 και EtOH1+TDD1 subgroups, respectively. The rest newborn rats from each group were left to grow until the end of the lactation period and in the same time the dams of all groups were receiving tap water and normal diet (same as the Control group). At the end of the lactation period sufficient amount of 21-day-old ofspring rats from each group were also weighted, sacrificed by decapitation and their brains were rapidly removed, providing tissue samples for the Control21, EtOH21, TDD21 και EtOH21+TDD21 subgroups, respectively. It should be also noted that all newborn and offspring rat groups from both experimental phases consisted of rats from both sexes. Tissue from whole brain and brain regions from the 1st experimental phase, as well as, whole brain tissue and liver tissue from the 2nd experimental phase, were rapidly removed, washed with isotonic buffer and weighted. In addition, liver tissue were immersed in formalin and were stained with haematoxylin-eosin stain. The obtained rat brain tissue was homogenized and the activities of AChE, (Νa+,Κ+)- ATPase and Mg2+-AΤΡase were assessed in all subgroups. Results: In the 1st experimental phase, exposure to EtOH during gestation has resulted in a statistically-significant inhibition of AChE in the 21-day-old offspring whole brain and frontal cortex of the EtOH(G) subgroup, as compared to the corresponding Control activities. The frontal cortex of the offspring of the EtOH(G+L) subgroup has also demonstrated a statistically-significant decrease in AChE activity when compared to the respective Control values. The 21-day-old offspring frontal cortex Νa+,Κ+-ΑΤΡase activities have also been particularly affected by the undertaken tratments: the homogenates of both EtOH(G) and EtOH(G+L) subgroups revealed an extensive (and statistically-significant) increase as compared to Control21 subgroup. Interestingly, the offspring whole brain, hippocampal and hypothalamic Νa+,Κ+-ΑΤΡase activities were not affected by the undertaken maternal exposure to ethanol, while the EtOH(G) cerebellar and pontine Νa+,Κ+-ΑΤΡase activities demonstrated statistically-significant changes when compared to Control21 activities. Finally, offspring Mg2+-ATPase was found to be stimulated to a statistically-significant level (as compared to that of the Control21 subgroup) in the hippocampal samples of both EtOH-exposed subgroups and unaffected in the whole brain, the frontal cortex and the pons. The EtOH(G+L) hypothalamic Mg2+-ATPase activity was found increased as compared to Control21, while an increase of this enzyme’s activity was also recorded in the EtOH(G+L) cerebellar samples as compared to the EtOH(G) subgroup. In the 2nd experimental phase, TDD treatment during gestation has resulted in a statistically-significant stimulation of AChE activity in the newborn whole brain as compared to the respective Control1 activity. In addition, the 21-day-old offspring whole brain of the EtOH21 subgroup has resulted in a statistically-significant increase of the AChE activity as compared to the respective Control21 activity. Instead, at the subgroup TDD21+EtOH21 which ethanol and thiamine deficient diet were co-administated, a statistically-significant inhibition of the AChE activity of the 21-day-old whole brain was presented as compared to the respective Control21 activity. Same response was resulted in the whole brain AChE activity of the TDD21+EtOH21 subgroup as compared to the TDD21 subgroup. The newborn whole brain Νa+,Κ+-ΑΤΡase activities have also been particularly affected by the undertaken treatments: the homogenates of both EtOH1 and ΤDD1+EtOH1 subgroups revealed a statistically-significant increase in the Νa+,Κ+-ΑΤΡase activity, as compared to Control1 subgroup. Instead, the newborn whole brain Νa+,Κ+-ΑΤΡase activity of the TDD1 subgroup was found decreased, as compared as compared to Control1 subgroup. Interestingly, the newborn whole brain Νa+,Κ+-ΑΤΡase activity of the ΤDD1+EtOH1 subgroup revealed an extensive increase as compared to TDD1 subgroup. In addition, the 21-year-old offspring whole brain Νa+,Κ+-ΑΤΡase activity of the TDD21+EtOH21 subgroup was presented statistically-significant enhanced as compared to Control21 subgroup. Finally, the whole brain Mg2+-ATPase activities of both newborn and 21-day-old offspring rats were found unaffected under all examined subgroups. After histopathological examination of all the examined subgroups, in the 2nd experimental phase, no significant alterations were observed in both newborn and 21-day-old rat livers as compared to the respective Control subgroups.Conclusions: The experimental design of the 1st experimental phase on the present study, compares the neurotoxic effects of maternal exposure to EtOH in a broader time frame (pregnancy and lactation), which in humans corresponds to neurodevelopmental CNS period during the third trimester of pregnancy, and also reveales the vulnereability of critical neurochemical parameters by specific brain region, through the different EtOH exposed schemed that were implemented. Among the considered enzymatic parameters of particular importance is the demonstrated extensive stimulation of Na+, K+-ATPase in the frontal cortex of the 21-day-old offspring rats, which is likely due to the reduced degree of dendrites branching in this specific brain region due to maternal exposure in EtOH. In contrast, the inhibition of cerebellar Na+, K+-ATPase activity of the 21-day-offspring rats, may indicate the existence of a region-specific alteration in the activity of this enzyme, which may be due to different histology and function of the examined brain regions, during the delicate period of neuronal development. Finally, the significant increament that was observed in the hippocampal Mg2+-ATPase activity of the 21-day-old offspring rats, is a finding that reported for the first time in the relative literature, since very little is known on the effects of maternal exposure to EtOH in the brain Mg2+-ATPase activity of the offsprings (existing findings are mainly related to the effects of EtOH exposure in the adulthood period). This enhancement in 21-day-old offspring hippocampal Mg2+-ATPase activity can be translated: (i) as an indicator for this specific brain region, regarding the neurotoxicity induced by FASD, and / or (ii) a cellular responce of this specific brain region to overcome the structural neurodevelopmental delay from EtOH exposure, by increasing the rate of protein synthesis and cell growth. Despite the aforementioned interesting findings, further research is needed in order to simulate and elucidate the pathophysiology of milder forms of FASD. In the 2nd experimental phase of the present study, a finding of particular interest is the observed increase in the newborn rats whole brain AChE activity of TDD1 subgroup, compared to the Control1 subgroup, which may be due to one or more of the following mechanisms: i) the reduction of physiological inhibition of the AChE activity due to the ability of the T to act as an in vitro AChE inhibitor and to block the transmission of nerve impulses in vivo, ii) the affect of TD-state on the cholinergic system (and therefore the activity of AChE), may be induced by the complicated and largely unspecified synergistic interactions between different brain neurotransmitter systems, and iii) the observed stimulation in the AChE activity of the TDD1 subgroup, may be due to a possible response of the cholinergic system to compensate for the reduced levels of neurotransmission due to possible ROS accumulation in the brain (as a result of cellular alterations in the TD-state), during prenatal exposure to TD. The observed recovery on the 21-day-old offspring whole brain AChE activity of the TDD21 subgroup, may be due the sufficient amount of T uptake through lactation that restores the normal cholinergic function. In the co-administration subgroups, the observed reduction in the 21-day-old offspring whole brain AChE activity of the TDD21+EtOH21 subgroup, as compared to the Control21 subgroup, may be due to a reduction of the cerebral TPP levels because of the synergistic neurotoxic effects of EtOH exposure in combination to TD-state. Furthermore, the significant reduction also observed in the 21-day-old offspring whole brain AChE activity of the TDD21+EtOH21 subgroup, as compared to the TDD21 subgroup, demonstrates that the neurotoxic effects of co-administration are more pronounced, than those which can cause the TD-state itself. Regarding to the Na+, K+-ATPase activity findings, the observed decrease in the newborn whole brain TDD1 subgroup, as compared Control1 subgroup, is probably due to the decreased ATP synthesis resulting from the impaired catabolism of neuronal cells due to reduced TPP brain levels in TD-state. Instead, the observed increase in the newborn whole brain Na+, K+-ATPase activity of EtOH1 subgroup, compared to the Control1 subgroup, is probably related to the excessive glutamate release, that can cause neuronal damage, due to induced hyperstimulation. Furthermore, the observed increase in whole brain Na+, K+-ATPase activities of EtOH and TDD co-administration subgroups, in both newborns and 21-day-old offsprings, as compared to the respective Control subgroups, is possibly due to: the mitochondrial dysfunction, the induced energy loss, the oxidative stress because of ROS formation, the disturbances in cell proliferation and cell migration, and the induced cell death, at the delicate period of neuronal development. The extensive increase observed in the newborn whole brain Na+, K+-ATPase activity of TDD1+EtOH1 subgroup, compared to the TDD1 subgroup, may can be explained from the fact that the neurotoxic effects of EtOH exposure are much more severe than those caused by the TD-state, resulting to the observed enhancement of the newborn whole brain Na+, K+-ATPase activity of TDD1+EtOH1 subgroup. The whole brain Mg2+-ATPase activity was not revealed any significant changes in both newborn and 21-day-old offspring examined subgroups. Finally, after histopathological examination of all examined subgroups, we can assume that the in utero mild EtOH exposure did not cause any significant alterations in the histopathological picture of the liver, in both newborn and 21-day-old offspring rats.

Εισαγωγή: Είναι γνωστό ότι οι δραστικότητες των ενζύμων του εγκεφάλου, ακετυλχολινεστεράση (AChE), Νa+,Κ+-ΑΤΡάση και Mg2+-ATPάση, αποτελούν κρίσιμες παραμέτρους για την εκτίμηση της χολινεργικής λειτουργίας, της συναπτικής διεγερσιμότητας, αλλά και τον έλεγχο του ρυθμού πρωτεϊνοσύνθεσης και της κυτταρικής ανάπτυξης, αντίστοιχως. Οι δραστικότητες των ανωτέρω ενζύμων, υπόκεινται σε μεταβολές από την δράση ελευθέρων ριζών, ενώ παρουσιάζουν σημαντικές αποκλίσεις μεταξύ των διαφόρων εγκεφαλικών περιοχών κατά την πειραματική επαγωγή μεταβολικών διαταραχών οι οποίες επηρεάζουν (μεταξύ άλλων) και το ΚΝΣ. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι: (α) η διερεύνηση των επιδράσεων της ήπιας in vivo χορήγησης αιθανόλης (EtOH) (10% v/v στο πόσιμο ύδωρ) σε κυοφορούντες επίμυες, επί της δραστικότητας της AChE, της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης και της Mg2+-ATPάσης, τόσο σε ομογενοποιήματα ολικού εγκεφάλου, όσο και επί των ομογενοποιημάτων εγκεφαλικών δομών (μετωπιαίος φλοιός, ιππόκαμπος, υποθάλαμος, παρεγκεφαλίδα και γέφυρα) των απογόνων, όταν αυτή χορηγήθηκε καθ’ όλη τη διάρκεια της κύησης, αλλά και όταν χορηγήθηκε καθ’ όλη τη διάρκεια τόσο της κύησης, όσο και της γαλουχίας, καθώς και (β) η διερεύνηση των επιδράσεων της ήπιας in vivo χορήγησης EtOH ή/και δίαιτας ελλιπούς σε θειαμίνη (TDD) σε κυοφορούντες επίμυες, κατά τη διάρκεια της κύησης, επί της δραστικότητας των τριών ανωτέρω ενζύμων στα ομογενοποιήματα ολικού εγκεφάλου των απογόνων, σε συνδυασμό με τη μελέτη της ιστολογικής εικόνας του ήπατος αυτών, τόσο κατά την γέννηση, όσο και μετά το πέρας της γαλουχίας.Υλικά και Μέθοδοι: Για τoυς in vivo πειραματισμούς χρησιμοποιήθηκαν ενήλικες θήλεις και άρρενες επίμυες τύπου AlbinoWistar, οι οποίοι λάμβαναν τροφή και ύδωρ ανάλογα με τη διάθεση τους (ad libitum). Στη 1η πειραματική φάση οι θήλεις επίμυες αρχικά συστεγάστηκαν σε κλωβούς με άρρενες επίμυες (επιβήτορες), σε αναλογία 1 : 2 (αρσενικά : θήλεα), για να ζευγαρώσουν. Αφού επαληθεύτηκε το ζευγάρωμα, μετά από λήψη κολπικού επιχρίσματος, οι θήλεις επίμυες διαχωρίστηκαν από τους άρρενες επίμυες και διαχωρίστηκαν σε τρείς ομάδες: (i) ομάδα μαρτύρων (Control) (χορηγήθηκε κανονική δίαιτα και νερό βρύσης τόσο κατά την κύηση όσο και κατά τη γαλουχία), (ii) ομάδα EtOH(G) (χορηγήθηκε κανονική δίαιτα και 10% v/v EtOH, διαμέσω του πόσιμου ύδατος, κατά την κύηση), και (iii) ομάδα EtOH (G+L) (χορηγήθηκε κανονική δίαιτα και 10% v/v EtOH, διαμέσω του πόσιμου ύδατος, τόσο κατά την κύηση όσο και κατά την διάρκεια της γαλουχίας). Μετά το πέρας της γαλουχίας, οι ηλικίας 21 ημερών απόγονοι επίμυες από κάθε όμαδα ζυγίστηκαν και θανατώθηκαν με ακαριαίο αποκεφαλισμό, και ακολούθως, οι εγκέφαλοι τους απομονώθηκαν τάχιστα, παρέχοντας τα δείγματα εγκεφαλικού ιστού για τις αντίστοιχες υποομάδες Control, EtOH(G) και EtOH(G+L). Οι υπόλοιποι 21-ημερών απόγονοι επίμυες, χρησιμοποιήθηκαν έτσι ώστε να απομονωθεί ικανός αριθμός για κάθε μια από τις ακόλουθες εγκεφαλίκες δομές, επαρκής για τον προσδιορισμό των υπό μελέτη νευροχημικών παραμέτρων στα ομογενοποιήματα κάθε δομής: μετωπιάιος φλοίος, ιππόκαμπος, υποθάλαμός, περεγκεφαλίδα και γέφυρα. Στη 2η πειραματική φάση, αφού επαληθεύθηκε το ζευγάρωμα με τον ίδιο τρόπο όπως περιγράφηκε παραπάνω, οι θήλεις επίμυες διαχωρίστηκαν από τους άρρενες επίμυες και διαχωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες. Οι ομάδες που σχηματίστηκαν ήταν οι ακόλουθες: (i) ομάδα μαρτύρων (Control) (χορηγήθηκε κανονική δίαιτα και νερό βρύσης τόσο κατά την κύηση όσο και κατά τη γαλουχία), (ii) ομάδα EtOH (χορηγήθηκε κανονική δίαιτα και 10% v/v EtOH, διαμέσω του πόσιμου ύδατος, κατά την κύηση, (iii) ομάδα TDD (χορηγήθηκε ειδική τροφή ελλιπής στη βιταμίνη T και νερό βρύσης κατά την κύηση), και iv) ομάδα συνχορήγησης TDD+EtOH (συνχορηγήθηκε 10% v/v EtOH, διαμέσω του πόσιμου ύδατος, και ειδική τροφή ελλιπής στη βιταμίνη T κατά την κύηση). Σε κάθε ομάδα η χορήγηση των παραγόντων διήρκησε όσο και η κύηση. Κατά τη γέννηση, ικανός αριθμός νεογέννητων επίμυων από κάθε όμαδα ζυγίστηκαν και θανατώθηκαν με ακαριαίο αποκεφαλισμό, και ακολούθως, οι εγκέφαλοι τους απομονώθηκαν τάχιστα παρέχοντας τα δείγματα εγκεφαλικού ιστού για τις αντίστοιχες υποομάδες Control1, EtOH1, TDD1 και EtOH1+TDD1. Οι υπόλοιποι νεογέννητοι επίμυες από κάθε ομάδα αφέθηκαν να αναπτυχθούν, ενώ η χορήγηση τρόφης και νερού επανήλθε στο φυσιολογικό (όπως στην ομάδα Control) για όλες τις όμαδες. Μετά το πέρας της γαλουχίας, ικανός αριθμός των ηλικίας 21 ημερών απογόνων επίσης ζυγίστηκε και θανατώθηκε με ακαριαίο αποκεφαλισμό, και ακολούθως, οι εγκέφαλοι τους απομονώθηκαν τάχιστα παρέχοντας τα δείγματα εγκεφαλικού ιστού για τις για τις αντίστοιχες υποομάδες Control21, EtOH21, TDD21 και EtOH21+TDD21. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι όλες οι ομάδες απογόνων και στις δύο πειραματικές φάσεις αποτελούνταν από επίμυες και των δύο φύλων. Εν συνεχεία, οι ολικοί εγκέφαλοι και οι εγκεφαλικές δομές (μετωπιαίος φλοιός, ιππόκαμπος, υποθάλαμος, παρεγκεφαλίδα και γέφυρα) της 1ης πειραματικής φάσης, καθώς και οι ολικοί εγκέφαλοι και τα ήπατα της 2ης πειραματικής φάσης, μετακινήθηκαν γρήγορα, πλύθηκαν με ισοτονικό διάλυμα και ζυγιστήκαν άμεσα. Τα ήπατα, ακολούθως, τοποθετήθηκαν σε διάλυμα φορμόλης και ακολούθησε χρώση με αιματοξυλίνη–ηωσίνη. Οι ολικοί εγκέφαλοι και οι δομές εγκεφάλου ομογενοποιήθηκαν και εν συνεχεία μετρήθηκαν οι ενζυμικές δραστικότητες της AChE, της (Νa+,Κ+)- και της Mg2+-AΤΡάσης σε όλες τις προαναφερθείσες ομάδες.Αποτελέσματα: Στη 1η πειραματική φάση, η έκθεση σε EtOH κατά τη διάρκεια της κύησης προκάλεσε σημαντική μείωση στη δραστικότητα της AChE στον ολικό εγκέφαλο, όσο και στο μετωπιαίο φλοιό των απογαλακτισθέντων (ηλικίας 21 ημερών) απογόνων. Επίσης, σημαντική μείωση παρατηρήθηκε και στη δραστικότητα της AChE στο μετωπιαίο φλοιό των ηλικίας 21 ημερών απογόνων επιμύων, στην οποία χορηγήθηκε EtOH τόσο κατά τη διάρκεια της κύησης όσο και κατά τη γαλουχία. Η δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης στο μετωπιαίο φλοιό των ηλικίας 21 ημερών απογόνων επιμύων τόσο της ομάδας EtOH(G), όσο και της ομάδας EtOH(G+L), βρέθηκε ιδιαίτερα αυξημένη συγκριτικά με την ομάδα Control. Ενδιαφέρον, αποτελεί το γεγονός ότι η δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης στην παρεγκεφαλίδα και στη γέφυρα των ηλικίας 21 ημερών απογόνων επιμύων της ομάδας EtOH(G), σημείωσαν στατιστικώς σημαντική μείωση συγκριτικά με την ομάδα Control. H δραστικότητα της Mg2+-ATPάσης στoν ιππόκαμπο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων επιμύων τόσο της ομάδας EtOH(G), όσο και της ομάδας EtOH(G+L), βρέθηκε στατιστικώς σημαντικά αυξημένη συγκριτικά με την ομάδα Control. Τέλος, η δραστικότητα της Mg2+-ATPάσης στoν υποθάλαμο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων επιμύων της ομάδας EtOH(G+L) βρέθηκε σημαντικά αυξημένη συγκριτικά με την ομάδα Control, ενώ αύξηση παρατηρήθηκε επίσης και στην παρεγκεφαλίδα των ηλικίας 21 ημερών απογόνων επιμύων της ομάδας EtOH(G+L), όταν η τελευταία συγκρίθηκε με την ομάδα EtOH(G). Στη 2η πειραματική φάση, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στη δραστικότητα της AChE στον ολικό εγκέφαλο των νεογέννητων επιμύων στην οποία χορηγήθηκε TDD κατά την κύηση, συγκριτικά με την ομάδα Control1. Επίσης, σημαντική αύξηση παρατηρήθηκε και στη δραστικότητα της AChE στον ολικό εγκέφαλο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων στην ομάδα EtOH21, στην οποία χορηγήθηκε EtOH κατά την κύηση, συγκριτικά με την ομάδα Control21. Αντίθετα, στην ομάδα TDD21+EtOH21 στην οποία συγχορηγήθηκε EtOH και TDD κατά την κύηση, παρατηρήθηκε μείωση στη δραστικότητα της AChE στον ολικό εγκέφαλο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων, συγκριτικά με την ομάδα Control21. Ομοίως, σημαντική μείωση στη δραστικότητα της AChE στον ολικό εγκέφαλο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων επιμύων παρατηρήθηκε και στην ομάδα συγχορήγησης TDD21+EtOH21, όταν αυτή συγκρίθηκε με την ομάδα TDD21. Στη δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στον ολικό εγκέφαλο των νεογέννητων επιμύων στην ομάδα TDD1, εν αντιθέσει με τις ομάδες EtOH1 και ΤDD1+EtOH1 στις οποίες παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στη δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης, συγκριτικά με την ομάδα Control1. Επιπρόσθετα, σημειώθηκε ιδιαίτερα σημαντική αύξηση στη δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης στον ολικό εγκέφαλο των νεογέννητων επιμύων της ομαδας ΤDD1+EtOH1 όταν αυτή συγκρίθηκε με την ομάδα TDD1. Τέλος, στατιστικώς σημαντική αύξηση στη δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης παρατηρήθηκε και στον ολικό εγκέφαλο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων της ομάδας TDD21+EtOH21, όταν αυτή συγκρίθηκε με την ομάδα Control21. Η δραστικότητα της Mg2+-ATPάσης στον ολικό εγκέφαλο τόσο των νεογέννητων επιμύων όσο και στον ολικό εγκέφαλο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων, παρέμεινε ανεπηρέαστη σε όλες τις υπο μελέτη ομάδες είτε όταν αυτές συγκρίθηκαν με τις ομάδες Control1 και Control21, είτε με τις ομάδες TDD1 και TDD21. Τέλος, στα ιστοπαθολογικά αποτελέσματα της 2ης πειραματικής φάσης δεν παρατηρήθηκαν αξιοσημείωτες μεταβολές (συγκριτικά με τις αντίστοιχες ομάδες μαρτύρων), τόσο στις ομάδες έκθεσης των νεογέννητων απογόνων, όσο και σε αυτές των ηλικίας 21 ημερών απογονών.Συμπεράσματα: Ο πειραματικός σχεδιασμός που εφαρμόστηκε στην 1η πειραματική φάση συγκρίνει τις νευροτοξικές επιδράσεις της μητρικής έκθεσης σε EtOH σε ένα ευρύτερο χρονικό πλαίσιο (κύηση και γαλουχία), το οποίο στον άνθρωπο αντιστοιχεί στην νευροαναπτυξιακή περίοδο του ΚΝΣ κατά το τρίτο τρίμηνο κύησης, και επιπλέον, φανέρωσε μια ευαισθησία των υπό εξέταση κριτικών νευροχημικών παραμέτρων ανά συγκεκριμένη εγκεφαλική περιοχή, στα σχήματα έκθεσης σε EtOH τα οποία εφαρμόστηκαν. Αναφορικά με τα ευρήματα αναστολής της δραστικότητας της AChE, πιθανόν να οφείλονται στα χαμηλότερα εγκεφαλικά αποθέματα ACh (υπόστρωμα της AChE) των ηλικίας 21 ημερών απογόνων έπειτα από τη μητρική χορήγηση EtOH, τόσο κατά την διάρκεια της κύησης, όσο και κατά τη διάρκεια της κύησης σε συνδυασμό με τη γαλουχία. Ανάμεσα στις υπό εξέταση ενζυμικές παραμέτρους, ιδιαίτερης σημασίας χρήζει η εκτεταμένη διέγερση της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης στο μετωπιαίο φλοίο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων, η οποία πιθανώς να οφείλεται στον μειωμένο βαθμό διακλάδωσης των δενδριτών στη συγκεκριμένη εγκεφαλική δομή εξαιτίας της μητρικής έκθεσης σε EtOH. Αντίθετα, στη παρεγκεφαλίδα παρατηρήθηκε μείωση της δραστικότητας της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης, η οποία πιθανώς να υποδηλώνει την ύπαρξη μιας περιοχικά-ειδικής μεταβολής της δραστικότητας του ενζύμου αυτού, η οποία μπορεί να οφείλεται στην διαφορετική ιστολογική νεύρωση και λειτουργικότητα των υπό μελέτη εγκεφαλικών δομών. Τέλος, η σημαντική αύξηση που παρατηρήθηκε στην δραστικότητα της Mg2+-ATPάσης στoν ιππόκαμπο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων, αποτελεί ένα εύρημα που παρατηρείται για πρώτη φορά στη σχετική βιβλιογραφία, αφού πολύ λίγα στοιχεία είναι γνωστά ως σήμερα σχετικά με την επίδραση της μητρικής έκθεσης σε EtOH στην δραστικότητα της Mg2+-ATPάσης στον εγκέφαλο των απογόνων (τα υπάρχοντα διαθέσιμα ευρήματα αφορούν κυρίως επιδράσεις της έκθεσης σε EtOH στην περίοδο ενηλικίωσης). Επιπρόσθετα, η αύξηση στην δραστικότητα της Mg2+-ATPάσης στoν ιππόκαμπο των ηλικίας 21 ημερών απογόνων, μπορεί να: (i) δρα σαν ένας δείκτης για την συγκεκριμένη εγκεφαλική δομή, αναφορικά με την νευροτοξικότητα που προκαλέι το FASD, ή/και (ii) αποτελέι μια προσπάθεια των κυτάρων της συγκεκριμένης εγκεφαλικής δομής να αυξήσουν τον ρυθμό πρωτεϊνοσύνθεσης, επιταχύνοντας με αυτόν τον τρόπο την κυτταρική ανάπτυξη με απώτερο στόχο να ξεπεράσουν την εν δυνάμει (δομική) νευροαναπτυξιακή καθυστέρηση την οποία επάγει η έκθεση σε EtOH. Παρά τα προαναφερθέντα αξιοσημείωτα ευρήματα, περαιτέρω πειραματική έρευνα απαιτείται μελλοντικά με στόχο τη προσομοίωση και την διελεύκανση της παθοφυσιολογίας ηπιότερων μορφών FASD. Στη 2η πειραματική φάση, ιδιαίτερο ενδιαφέρον αποτελεί η παρατηρούμενη αύξηση στην δραστικότητα της AChE στον ολικό εγκέφαλο των νεογέννητων επιμύων της ομάδας TDD1, συγκριτικά με την ομάδα Control1, η οποία πιθανώς να οφείλεται σε έναν ή περισσότερους από τους παρακάτω μηχανισμούς: i) η ικανότητα της T να δρα σαν αναστολέας της δραστικότητας της AChE in vitro, αλλά και να μπλοκάρει την διαβίβαση νευρικών ερεθισμάτων in vivo, πιθανώς να σχετίζεται με τη μειώση της φυσιολογικής αναστολής της δραστικότητας της AChE, ii) πιθανώς η TD να επηρεάζει το χολινεργικό σύστημα (συνεπώς και την δραστικότητα της AChE), διαμέσω των πολύπλοκων και σε μεγάλο βαθμό αδιευκρίνιστων συνεργειακών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των διαφορετικών εγκεφαλικών νευροδιαβιβαστικών συστημάτων, και iii) η παρατηρούμενη αύξηση της δραστικότητας της AChE στην ομάδα TDD1 πιθανώς να αποτελεί μία προσπάθεια του χολινεργικού συστήματος να αντισταθμίσει τα μειωμένα επίπεδα νευροδιαβίβασης (εξαιτίας των κυτταρικών μεταβολών από την TD), από την συσσώρευση ROS στον εγκέφαλο κατά την προγεννητική έκθεση σε TD. Επιπρόσθετα, η παρατηρούμενη επαναφορά της δραστικότητα της AChE στον ολικό εγκέφαλο της ομάδας TDD21 στα φυσιολογικά επίπεδα, πιθανώς να οφείλεται στην επαναπρόσληψη ικανής ποσότητας T, διαμέσω του θηλασμού, η οποία και τελικώς να αποκαθιστά την ομαλή χολινεργική λειτουργία. Στις ομάδες συνχορήγησης, η παρατηρούμενη μείωση της δραστικότητας της AChE στην ομάδα TDD21+EtOH21, πιθανώς να οφείλεται στην μείωση των εγκεφαλικών επιπέδων TPP εξαιτίας των συνεργικών νευροτοξικών επιδράσεων της έκθεσης σε EtOH, σε συνδυασμό με την κατάσταση TD εξαιτίας της χορήγησης TDD. Επιπλέον, η σημαντική μείωση η οποία διαπιστώθηκε στη δραστικότητα της AChE στον ολικό εγκέφαλο της ομάδας συνχορήγησης TDD21+EtOH21, όταν αυτή συγκρίθηκε με την ομάδα TDD21, καταδεικνύει το γεγονός ότι οι νευροτοξικές επιδράσεις από την συνχορήγηση είναι εντονότερες, συγκριτικά με αυτές που μπορεί να προκαλέσει η κατάσταση TD από μόνη της. Αναφορικά με την δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης, η παρατηρούμενη μείωση στην ομάδα TDD1 των νεογέννητων επιμύων, συγκριτικά με την ομάδα Control1, πιθανώς να οφείλεται στη μειωμένη σύνθεση ATP που προκαλείται από την διαταραχή του καταβολισμου των νευρικών κυττάρων εξαιτίας των μειωμένων εγκεφαλικών επιπέδων της TPP σε κατάσταση TD. Αντίθετα, η παρατηρούμενη αύξηση στη δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης στην ομάδα EtOH1, συγκριτικά με την ομάδα Control1, πιθανώς να σχετίζεται με την εκτεταμένη απελευθέρωση γλουταμινικού οξέος, προκαλώντας νευρωνική βλάβη εξαιτίας της επαγόμενης υπερδιέργερσης. Στις ομάδες συνχορήγησης EtOH και TDD, τόσο στους νεογέννητους, όσο και στους 21 ημερών απογόνους, η παρατηρούμενη σημαντική αύξηση στη δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης στον ολικό εγκέφαλο, συγκριτικά με τις αντίστοιχες ομάδες Control, πιθανώς να οφείλεται στη μιτοχονδριακή δεισλειτουργία, την επαγόμενη απώλεια ενέργειας, στην πρόκληση οξειδωτικού στρες εξαιτίας του σχηματισμού ROS, στις διαταραχές κατά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμο και τη κυτταρική μετανάστευση, και τελικά στο κυτταρικό θάνατο, στο ευπρόσβλητο στάδιο της ανάπτυξης του νευρικού συστήματος. Σχετικά με την ιδιαίτερα σημαντική αύξηση στη δραστικότητα της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης στον ολικό εγκέφαλο των νεογέννητων επιμύων της ομαδας συνχορήγησης ΤDD1+EtOH1, συγκριτικά με την ομάδα TDD1, μπορούμε να συμπαιράνουμε ότι οι νευροτοξικές επιδράσεις της χορήγησης EtOH υπερισχύουν αυτών που προκαλούνται από την TD, οδηγώντας τελικά σε αύξηση της δραστικότητας της Νa+,Κ+-ΑΤΡάσης στον ολικό εγκέφαλο της ομαδας συνχορήγησης ΤDD1+EtOH1. Η δραστικότητα της Mg2+-ATPάσης στον ολικό εγκέφαλο, τόσο των νεογέννητων, όσο και των ηλικίας 21-ημερών απογόνων, δε παρουσίασε καμία μεταβολή σε όλες τις υπο μελέτη ομάδες. Τέλος, μπορούμε να συμπαιράνουμε ότι όταν η in utero χορήγηση της EtOH πραγματοποιείται σε ήπιες δόσεις, όπως στη παρούσα διατριβή, δεν προκαλούνται σημαντικές μεταβολές στην ιστοπαθολογική εικόνα του ήπατος, τόσο κατά την γέννηση, όσο και μετά το πέρας της γαλουχίας