Συγκριτική μελέτη του μεταβολικού προτύπου εγκεφαλικών περιοχών ενηλίκων μυών με μεθόδους συστημικής βιολογίας

Abstract

The mammalian brain is a highly complex organ that integrates multiple regions with diverse functional roles, biochemical characteristics and physiological dynamics. To-date, the study of brain biochemistry is mainly studied with respect to few selected “biomarker” molecules in specific brain region(s) considered to be correlated with the investigated physiological conditions. However, there is the need for mapping of brain molecular physiology in a systemic and systematic way in the context of brain regional variation. This can be achieved through the Systems Biology field through high throughput biomolecular analyses or else omic analyses and more specifically metabolomics analysis used in the current work. In this context, the main objective of this study was the application of Systems Biology methods in the study of brain molecular physiology of an animal model of specific pathophysiology. The studied pathophysiology refers to adult onset hypothyroidism (AOH) for which current knowledge remains fragmented with respect to the varied experimental setups involved creating the need for a holistic analysis of its effect on brain metabolism. More specifically, metabolomic analysis was applied in the study of metabolic physiology of five brain regions (cortex, cerebellum, midbrain, hippocampus and striatum) in both sexes in an animal model of AOH using GasChromatography-Mass Spectrometry (GC-MS). AOH was induced in a chemical way through administration of 1% w/v KClO4 in the drinking water of 2-month old Balb/cJ mice for a period of 60 days. The application of metabolomics in brain research requires the standardization of pre- and analytical and also computational steps that results to the metabolic network reconstruction and analysis. We analyzed 245 biological samples that correspond to 735 metabolic profiles. The identification, filtering and normalization procedures resulted in 73 common metabolites in cortex, cerebellum and midbrain, while the metabolic rpofile of hippocampus and straitum consists of 49 and 45 metabolites, respectively. The sensitivity limits of our method declare that the lower number of identified metabolites in these two brain regions is not attributed to the low sample olume while if these metabolitew were present they would be identified. The multivariate statistical analysis showed that the main discriminating factor of our metabolomic dataset is the metabolic brain regional variation under physiological conditions. Cortex, cerebellum and midbrain rely to glucose-centric metabolism while hippocampus and striatum are lipid-centric. Cortex is characterized of high levels of signalling and antioxidant defense while midbrain exerts high levels of cholesterol and molecules that other than their metabolic role they also act as neurotransmitters. Arachidonic acid related with learning-memory procedures and also neurogenesis exerts highest levels in hippocampus. Striatum is rich in lipids like octadecanoic acid and myristate. We also observed sex-specific alterations in the metabolic activity of brain regions in atissue-specific way with midbrain being this brain regions that presents no sex related metabolis changes while cerebellum has the most differentaited metabolis profile in female as to male animla under physiological conditions. Scyllo-inositol, related with glycolysis, has statistically significant decreased relative concentration and Un_0060 has statistically significant increased relative concentration in female as to male mice in all brain regions, that make these molecules being markers of sex-specificity. Taking into onsideration the tissue interaction with vascular system, we standradized kai applied a heart perfusion protocol (0.9% w/v NaCl) for blood removal from animal’s body. Our results showed that the blood removal caused quantitative changes in each brain region but without affecting the metabolic physiology of them. Specifically, we observed decreased relative concentration in molecules like glucose and glycerol that brain takes exclusively from the blood circulation and related with glucose-centric metabolism and promotion of lipid-centric metabolism for anaplerosis of TCA cycle. Concluding, brain tissue is metabolically self-reliant with respect to β-oxidation of PUFAs while glucose-centric metabolism is attributed mainly to metabolites that derive mainly from blood circulation.With regard to AOH our results showed that its effect on brain metabolic physiolgy is region and sex-specific with females being less influenced than males. The main differentiated metabolic pathwyas refer to glucose-centric, lipid-centric metabolism and antioxidant defense. After blood removal from animal’s body, comparative analysis of the AOH effect on brain metabolic physiology showed that cortex is the onaly brain region that is affected to similar metabolic pathways as non-perfused samples in both sexes. Concluding, self-reliant brain metabolic pathyaws are not affected under AOH conditions. Conclusively, through this study we highlight the significance of systems analysis in understanding brain metabolic complexity in the context of the reconstructed network. In this thesis, mapping of the metabolic profile of five specific brain regions in both sexes and study of the metabolic pathways that differentiate them were performed. AOH affected brain metabolic physiology in a region-specific and sex-dependent manner while blood removal from tissue is a parameter that should be taken into consideration in the experimental design of such studies. It becomes clear, that the revolutionary perspective of high-throughput analysis triggers the combination between molecular biology and neurophysiology towards a new challenging research field that we call as Molecular Systems Neurophysiology.

Ο εγκέφαλος αποτελεί ένα όργανο υψηλής πολυπλοκότητας το οποίο αποτελέιται από επιμέρους περιοχές με διαφορετικούς λειτουργικούς ρόλους και βιοχημικά χαρακτηριστικά. Η βιοχημεία του δεν είναι πλήρως μελετημένη καθώς οι περισσότερες ερευνητικές ομάδες εστιάζουν στη μελέτη λίγων επιλεγμένων μορίων σε μια ή δύο εγκεφαλικές περιοχές οι οποίες συνδέονται με την υπό μελέτη παθολογική κατάσταση στο αρσενικό κυρίως φύλο. Κατ’ αυτό τον τρόπο υπάρχει ανάγκη συστημικής και συστηματικής μελέτης της μεταβολικής φυσιολογίας του εγκεφάλου στο πλάισιο των επιμέρους εγκεφαλικών περιοχών και του φύλου. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί μέσω του πεδίου της Συστημικής Βιολογίας και μέσω των υψηλής απόδοσης βιομοριακών αναλύσεων ή αλλιώς ομικών αναλύσεων και πιο συγκεκριμένα της μεταβολομικής ανάλυσης που χρησιμοποιείται στην παρούσα διατριβή. Στο πλαίσιο αυτό ευρύτρεος στόχος της παρούσας διατριβής τέθηκε η εφαρμογή μεθόδων Συστημικής Βιολογίας στη μελέτη της μοριακής φυσιολογίας εγκεφάλου μοντέλου μυός συγκεκριμένης παθοφυσιολογίας. Η υπό μελέτη παθοφυσιολογία αφορά το χρόνιο υποθυρεοειδισμό ενηλίκων (ΧΥΕ) για τον οποίο οι τρέχουσες βιβλιογραφικές αναφορές δεν συνηγορούν σε μια άποψη λόγω διαφορετικών πρωτοκόλλων και χειρισμών που ακολουθούνται κάθε φορά, δημιουργώντας την ανάγκη ολιστικής μελέτης της επίδρασής του στη μεταβολική φυσιολογία του εγκεφάλου. Αναλυτικότερα έγινε εφαρμογή της μεταβολομικής ανάλυσης στη μελέτη της φυσιολογίας πέντε επιμέρους εγκεφαλικών περιοχών (φλοιός, παρεγκεφαλίδα, μεσεγκέφαλος, ιππόκαμπος και ραβδωτό) και των δύο φύλων σε μοντέλο μυός Χρόνιου Ενήλικου Υποθυρεοειδισμού (ΧΕΥ) με χρήση Χρωματογραφίας Αερίων-Φασματομετρίας Μάζας (ΧΑ-ΦΜ). Ο ΧΥΕ επάχθηκε μέσω χορήγησης 1% w/v KClO4 στο πόσιμο νερό 2μηνών πειραματοζώων για χρονικό διάστημα 60 ημερών. Η εφαρμογή της μεταβολομικής ανάλυσης στον εγκεφαλικό ιστό απαιτεί την προτυποποίηση τόσο των προ- και αναλυτικών αλλά και υπολογιστικών βημάτων καταλήγοντας στην ανακατασκευή του εν δυνάμει μεταβολικού δικτύου. Συνολικά αναλύθηκαν 245 βιολογικά δείγματα τα οποία αντιστοιχούν σε 735 μεταβολικά πρότυπα. Η διαδικασία της ταυτοποίησης, του φιλτραρίσματος και της κανονικοποίησης των μεταβολομικών δεδομένων κατέληξε σε 73 κοινούς μεταβολίτες του κεντρικού μεταβολισμού του άνθρακα στο φλοιό, την παρεγκεφαλίδα και το μεσεγκέφαλο ενώ λόγω του μικρότερου μεγέθους τους, το προτύπου του ιπποκάμπου αποτελείται από 49 και του ραβδωτού από 45 από αυτούς τους μεταβολίτες. Η πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση έδειξε ότι η κύρια παράμετρος διαχωρισμού των μεταβολομικών δεδομένων είναι η μεταβολική διαφοροποίηση των επιμέρους εγκεφαλικών περιοχών υπό φυσιολογικές συνθήκες. Ο φλοιός, η παρεγκεφαλίδα και ο μεσεγκέφαλος στηρίζονται κυρίως στο γλυκο-κεντρικό μεταβολισμό ενώ οι δυο μικόρτρες επριοχές στον λιπιδο-κεντρικό μεταβολσιμό. Ο φλοιός παρουσιάζει επίσης αυξημένη σηματοδότηση και αντιοξειδωτική άμυνα ενώ ο μεσεγκέφαλος έχει υψηλές συγκεντρώσεις σε χοληστερόλη και σε μόρια που εκτός του σηματοδοτικού τους ρόλου δρούν και ως νευροδιαβιβαστές. Το αραχιδονικό οξύ που σχετίζεται με τις διαδικασίες μνήμης-μάθησης και νευρογένεσης είναι το χαρακτηριστικό μόριο του ιπποκάμπου. Τέλος το ραβδωτό είναι περιοχή πλούσια σε λιπίδια όπως οκταδεκανοϊκό και μυριστικό οξύ. Παρατηρήθηκε επίσης φυλοειδικότητα η οποία εκφράζεται με ιστοειδικό τρόπο με το μεσεγκέφαλο να είμαι μη φυλοειδική περιοχή ενώ η παρεγκεφαλίδα παρουσιάζει το πλέον διαφοροποιημένο προτύπου μεταξύ των δυο φύλων. Η scyllo-ινοσιτόλη που συνδέεται με τη γλυκόλυση εμφανίζεται στατιστικώς σημαντικά μειωμένη και το άγνωστο μόριο Un_0060 στατιστικώς σημαντικά αυξημένο στις περιοχές των θηλυκών ως πρός τα αρσνεικά πειραματόζωα αποτελόντας δείκτες της φυλοειδικότητας.Λαμβάνοντας υπόψη τις αγγειακές αλληλεπιδράσεις των ιστών με το αίμα έχει αριστοποιηθεί και εφαρμοστεί πρωτόκολλο διαπότισης (χρήση 0.9% w/v NaCl) για την απομάκρυνση του αίματος από το σώμα των πειραματοζώων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μετά την απομάκρυνση του αίματος αν και παρατηρούνται ποσοτικές αλλαγές σε κάθε εγκεφαλική περιοχή, δεν επηρεάζεται η καθεαυτό φυσιολογία του ιστού. Αναλυτικότερα παρατηρήθηκε και στα δυο φύλα μείωση της σχετικής συγκέντρωσης μορίων τα οποία ο ιστός λαμβάνει από την κυκλοφορία του αίματος και σχετίζονται με το γλυκο-κεντρικό μεταβολισμό και ανάδειξη του λιπιδο-κεντρικού μεταβολισμού για αναπλήρωση του κύκλου του κιτρικού οξέος οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι ο ιστός βασίζεται στ δικό του μεταβολισμό όσον αφορά τη β-οξείδωση λιπιδίων ενώ όσον αφορά το γλυκο-κεντρικό του μεταβολσιμό στηρίζεται κυρίως στο αίμα. Ο ΧΥΕ επηρεάζει τη μεταβολική φυσιολογία του εγκεφάλου με ιστοειδικό και φυλοειδικό τρόπο με τα θηλυκά πειραματόζωα να είναι λιγότερο επηρεασμένα. Τα κύρια μεταβολικά μονοπάτια που επηρεάζονται αφορούν στο γλυκο-κεντρικό, λιπιδο-κεντρικό μεταβοσλιμό και την αντιοξειδωτική άμυνα. Μετά την απομάκρυνση του αίματος, συγκριτική ανάλυση της επίδρασης του ΧΥΕ στη μεταβολική φυσιολογία των επιμέρους εγκεφαλικών περιοχών έδειξε ότι ο φλοιός είναι η μόνη περιοχή που επηρεάζεται από την υπό μελέτη διαταραχή σε παρόμοια μεταβολικά μονοπάτια με τα μη διαποτισμένα δείγματα και στα δυο φύλα οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι τα μεταβολικά μονοπάτια για τα οποία ο ιστός στηρίζεται στο δικό του μεταβολισμό δεν επηρεάζονται από το ΧΥΕ. Συμπερασματικά, μέσω της μελέτης αυτής φαίνεται η σημαντικότητα της συστημικής ανάλυσης για την κατανόηση της πολυπλοκότητας του εγκεφάλου στο πλαίσιο του ανακατασκευασμένου δικτύου. Στα πλάισια αυτά πραγματοποιήθηκε χαρτογράφηση του μεταβολιού προτύπου των πέντε επιμέρους εγκεφαλικών περιοχών και των δυο φύλων και μελέτη των μεταβολικών μονοπατιών που τις διαφοροποιούν. Ο ΧΥΕ επηρεάζει τη μεταβολική φυσιολογία του εγκεφάλου με ιστοειδικό και φυλοειδικό τρόπο ενώ η αλληλεπίδραση των ιστών με το αίμα είναι μια παράμετρος η οποία θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κάθε φορά. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής αποδεικνύουν ότι το νέο πεδίο της Συστημικής Βιολογίας είναι ικανό να προσεγγίσει τον εγκέφαλο με ολιστικό τρόπο και να γεφυρώσει το χάσμα μεταξύ της μοριακής βιολογίας και της νευροφυσιολογίας ορίζοντας για πρώτη φορά ένα νέο πεδίο στην έρευνα του εγκεφάλου, αυτό της Μοριακής Συστημικής Νευροφυσιολογίας.