Σχεδιασμός και σύνθεση πεπτιδομιμητικών μορίων με βάση το τριμοριακό σύμπλοκο MHC-πεπτίδιο-TCR

Abstract

Multiple Sclerosis (MS) is an immunologically controlled, inflammatory, demyelinating disease, characterized by the destruction of the white matter (myelin) of the Central Nervous System (CNS), leading to serious medical conditions and paralysis. The main cause of the disease is still unclear. However, it is believed to be mediated by an autoimmune T-cell response directed to the proteins of the myelin sheath, such as the Myelin Basic Protein (MBP). The T-cell response is triggered by the formation of the trimolecular complex between the Major Histocompatibility Complex [MHC (HLA)], the immunodominant myelin protein epitopes and the T-cell receptor (TCR). In this thesis, a detailed mapping of the interactions that occur during the creation of the trimolecular complex HLA-peptide antigen-TCR took place. The mentioned procedure provides the stereochemical characteristics that are essential for the rational design of inhibitors. In this study, MBP83-96 was used as the antigen. The mentioned epitope was specifically chosen because it is identified as the main immunodominant epitope in MS patients. The model of HLA and TCR receptors was obtained from the crystallographic data (pdb: 1YMM). Our main goal was the rational design of peptide mimetic molecules that bind to the TCR, without interacting with the HLA receptor. The new molecules, were designed to prevent the formation of the trimolecular complex and the further multiplication and activation of the encephalitogenic T-cells that are involved in MS.For this study, a pharmacophore model was designed based on the MBP83-96 epitope and the following experiments were carried out. i) Molecular Docking simulations, ii) Molecular Dynamic experiments as well as iii) QM/MM calculations in order to predict the possible interactions between the proposed analogues and the TCR. The software used were MOE2010, AMBER12, MOPAC2012 and Gaussian09 in a LINUX operating system. The proposed molecules were synthesized and characterized via ESI-MS, 1H-NMR and 13C-NMR. The composed analogues were tested in vitro in order to be evaluated as activation inhibitors of the encephalitogenic T-cells.

Η Σκλήρυνση Κατά Πλάκας (ΣΚΠ) είναι μια ανοσολογικά ελεγχόμενη, φλεγμονώδης, απομυελινωτική ασθένεια, η οποία χαρακτηρίζεται από καταστροφή τη μυελίνης του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) που οδηγεί σε σοβαρές παθολογικές καταστάσεις και παράλυση. Η κύρια αιτία της νόσου δεν έχει διευκρινιστεί, με επικρατέστερη θεωρία εμφάνισής της, εκείνη της αυτοανοσίας η οποία περιλαμβάνει το σχηματισμό του τριμοριακού συμπλόκου μεταξύ του Μείζονος Συστήματος Ιστοσυμβατότητας [MHC (HLA)], ανοσοκυρίαρχων επιτόπων των πρωτεϊνών της μυελίνης και του Υποδοχέα των Τ-κυττάρων (TCR). Στην παρούσα διατριβή, πραγματοποιήθηκε λεπτομερής χαρτογράφηση των αλληλεπιδράσεων που λαμβάνουν χώρα κατά τη δημιουργία του τριμοριακού συμπλόκου HLA- πεπτιδίου αντιγόνο-TCR, η οποία θα μπορούσε να δώσει τα απαραίτητα χαρακτηριστικά για τον ορθολογικό σχεδιασμό αναστολέων. Επίσης πραγματοποιήθηκε διαμορφωτική μελέτη του τριμοριακού συμπλόκου χρησιμοποιώντας ως πεπτίδιο-αντιγόνο τον επίτοπο ΜΒΡ83-96, καθώς έχει βρεθεί ότι αναγνωρίζεται σε μεγάλο ποσοστό από κύτταρα ασθενών με ΣΚΠ, ενώ χρησιμοποιήθηκαν οι υποδοχείς HLA και TCR από κρυσταλλογραφικά δεδομένα (pdb: 1YMM). Κύριος στόχος ήταν ο ορθολογικός σχεδιασμός πεπτιδομιμητικών μορίων τα οποία θα ενώνονται με τον υποδοχέα TCR, χωρίς να δεσμεύονται με τον HLA. Οι νέες ενώσεις σχεδιάστηκαν με σκοπό να εμποδίσουν τη δημιουργία του τριμοριακού συμπλόκου και συνεπώς να αναστείλουν τον περαιτέρω πολλαπλασιασμό και ενεργοποίηση των εγκεφαλιτογόνων Τ-κυττάρων που εμπλέκονται στη ΣΚΠ. Για τη μελέτη, έγινε σχεδιασμός του φαρμακοφόρου μοντέλου με βάση τον επίτοπο MBP83-96, πραγματοποιήθηκαν πειράματα i) μοριακής πρόσδεσης (docking), ii) προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής (dynamics) καθώς κ iii) πειράματα κβαντικής μηχανικής/ μοριακής μηχανικής (QM/MM) για να προβλέψουμε τις πιθανές αλληλεπιδράσεις των αναλόγων με τον υποδοχέα TCR. Χρησιμοποιήθηκαν τα λογισμικά πρόγραμμα ΜΟΕ, AMBER, MOPAC και Gaussian σε λογισμικό περιβάλλον LINUX. Ακολούθησε η σύνθεση των προτεινόμενων αναλόγων, η ταυτοποίηση των οποίων έγινε με ESI-MS, 1H-NMR καθώς και 13C-NMR. Τα συντιθέμενα ανάλογα, δοκιμάστηκαν σε in vitro πειράματα με σκοπό την αξιολόγησή τους ως αναστολείς ενεργοποίησης των εγκεφαλιτογόνων Τ-κυττάρων.