Ο µοριακός µηχανισµός της στόχευσης των προ-πρωτεϊνών στα βακτήρια

Abstract

Almost 500 Escherichia coli proteins are secreted post-translationally through thebacterial translocase (SecA-SecYEG). Secretory proteins are comprised by the signalpeptide and the mature domain. The two parts have targeting signals and bind ondistinct sites on the translocase. The subject of the thesis is to resolve the nature of thetargeting signals on the mature domain. Using several secretory proteins we foundthat ~100 amino acids are sufficient for targeting. Lowering the amino acids length,the affinity is reducing, implying that ~100 amino acids are necessary for targeting.The reduction coincides with the removal of the hydrophobic patches of the sequence.Mutagenizing the hydrophobic amino acids of the patches and making the sequenceneutral the affinity is lowering. In the absence of a signal peptide the affinity isabolished. We conclude that for mature domain targeting, the substrate must have atleast one hydrophobic patch. It is known that a protein is stable in a solubleenvironment when it buries its hydrophobic core by folding. A prerequisite fortargeting is the protein to be unfolded. How do secretory proteins manage to exposetheir hydrophobic patches in a soluble environment? Testing the behavior of thesecreted proteins in soluble environment we discovered that 50% remain soluble,targeting and translocation competent. A condition that we name natively unfolded.The other 50% precipitates mainly because of their signal sequence. The cell dealswith the aggregating proteins by having several different chaperones (SecA, SecB,Trigger factor) that prevent their aggregation. The chaperones apart from preventingthe aggregation they maintain the proteins into a translocation competent state. Nextwe tested if the cytoplasmic proteins become targeted. Cytoplasmic proteins havehydrophobic patches similar to the secreted and they become targeted to thetranslocase. The period of time they remain targeting competent is less compared tothe secreted. Concluding the mature domain targeting signals are 1. The hydrophobicsegments and 2. The non-native code. The secretory proteins have been evolved tostay unfolded and become targeted. The expense of staying unfolded –in some casesisto aggregate, a cost that the cell takes in order the proteins to remain non-native.Next we searched for the targeting signals on SecA. SecA has hydrophobic patcheson its cytoplasmic side. We immobilized the c-tail on a hydrophobic patch the affinitywas reduced 10 times. We identified a hydrophobic patch that participates in targeting although it is not unique. We conclude that targeting is mediated through hydrophobicinteractions.To test if the signal peptide affects targeting, we exchanged the signal peptide ofalkaline phosphatase with 23 other E.coli signal peptides. The targeting changedslightly but the secretion and the activation energy of the holoenzyme was highlyaffected.

Περίπου 500 πρωτεΐνες του Escherichia coli εκκρίνονται µετα-µεταφραστικά από τηνµεταθετάση του κυττάρου (SecY-SecA). Οι εκκριτικές πρωτεΐνες αποτελούνται απότο πεπτίδιο σήµα και το ώριµο µέρος. Τα δύο µέρη προσδένονται σε διακριτές θέσειςστη µεταθετάση. Στόχος της διατριβής είναι να βρούµε τα σήµατα στόχευσης τουώριµου τµήµατος για την µεταθετάση. Χρησιµοποιώντας διαφορετικές εκκριτικέςπρωτεΐνες καταλήξαµε ότι ~100 αµινοξέα είναι ικανά προκειµένου να στοχευθεί µιαπρωτεΐνη στη µεταθετάση. Στη συνέχεια χρησιµοποιώντας την αλκαλική φωσφατάσηως πρωτεΐνη µοντέλο, δηµιουργήσαµε πρωτεΐνες-παράγωγά της- µικρότερες από 100αµινοξέα. Η συγγένειά τους για τη µεταθετάση µειώνεται καθώς µειώνεται το µήκοςτους. Εποµένως ~100 αµινοξέα είναι αναγκαία για τη στόχευση. Οι µεγαλύτερεςµειώσεις της συγγένειας συµπίπτουν µε την αφαίρεση 2 υδρόφοβων νησίδων.Προκειµένου να εξετάσουµε αν οι νησίδες είναι σηµαντικές για τη στόχευση,µεταλλάξαµε τα υδρόφοβα αµινοξέα δηµιουργώντας αλληλουχίες ουδέτερηςυδροφοβικότητας. Όταν 1. µεταλλάχθηκαν και οι δύο νησίδες και 2. το υπόστρωµαδεν έχει πεπτίδιο σήµα τότε χάνεται η συγγένεια της πρωτεΐνης για την µεταθετάση.Εποµένως το ώριµο τµήµα πρέπει να έχει τουλάχιστον µια υδρόφοβη νησίδαπροκειµένου να στοχευθεί. Οι πρωτεΐνες προκειµένου να είναι σταθερές στοκυτταρικό περιβάλλον και να µην κατακρηµνίζονται, πρέπει να σχηµατίσουνυδρόφοβο πυρήνα, να κρύψουν τα υδρόφοβα µέρη τους και εποµένως νααναδιπλώσουν. Γνωρίζουµε οστώσο ότι µόνο οι αποδιπλωµένες πρωτεΐνεςστοχεύονται και εκκρίνονται. Δηµιουργείτε η απορία πώς οι εκκρινόµενες πρωτεΐνεςκαταφέρνουν να χρησιµοποιούν τις υδρόφοβες νησίδες τους και να στοχεύονται.Δοκιµάσαµε τη σταθερότητα των εκκριτικών πρωτεϊνών σε υδατικό διάλυµα. Το 50%παραµένει σταθερό και ικανό για στόχευση και έκκριση. Οι πρωτεΐνες προκειµένουνα στοχευθούν πρέπει να είναι αποδιπλωµένες, εποµένως καταλήγουµε στοσυµπέρασµα ότι οι παραπάνω πρωτεΐνες παραµένουν εγγενώς αποδιπλωµένες. Toυπόλοιπο 50% κατακρηµνίζεται. Οστώσο το κύτταρο έχει πολλαπλές επιλογές για τιςεκκρινόµενες πρωτεΐνες που κατακρηµνίζονται. Τουλάχιστον 3 πρωτεΐνες (SecA,SecB, Trigger Factor) µπορούν να «σώσουν» τις εκρινόµενες πρωτεΐνες από τηνκατακρήµνιση αλλά και να τις διατηρήσουν ικανές για µετατόπιση. Οικυτταροπλασµατικές, έχουν υδρόφοβες νησίδες παρόµοιες µε αυτές τωνεκκρινόµενων και προσδένονται στην µεταθετάση. Η διαφορά τους έγγειται στο ότι το χρονικό περιθώριο που παραµένουν ικανές για στόχευση είναι µικρότερο από τωνεκκρινόµενων. Καταλήγοντας τα σήµατα στόχευσης είναι 1. Οι υδρόφοβες νησίδεςκαι 2. Η τάση των εκκρινόµενων να παραµένουν αποδιπλωµένες.Εξετάζοντας τα σήµατα στόχευσης από την πλευρά της SecA, παρατηρήσαµε ότιυπάρχουν υδρόφοβες νησίδες στην κυτταροπλασµατική πλευρά της SecA. Ότανακινητοποιήσαµε την καρβοξυτελική ουρά της SecA σε µια από τις νησίδες, ησυγγένεια στόχευσης των υποστρωµάτων έγινε 10 φορές µικρότερη . Εποµένως ησυγκεκριµένη περιοχή αν και φαίνεται να µην είναι µοναδική, είναι σηµαντική γιατην πρόσδεση υποστρωµάτων.Όταν ελέγξαµε αν το πεπτίδιο σήµα επηρεάζει τη στόχευση αντικαθιστώντας τοπεπτίδιο σήµα της αλκαλικής φωσφατάσης µε 30 άλλα πεπτίδια σήµαταπαρατηρήσαµε ότι οι διαφορές στη συγγένεια ήταν µικρές. Αντίθετα το πεπτίδιοσήµα είναι καθοριστικό για την αποτελεσµατικότητα της έκκρισης και για τη µείωσητης ενέργειας ενεργοποίησης του ολοενζύµου (SecY-SecA).