Θερμοδυναμική σταθερότητα πρωτεϊνών: συσχέτιση με αρχιτεκτονική λειτουργικών περιοχών και συνθήκες κρυστάλλωσης

Abstract

In Protein Science, one of the major research challenges has been the correlation of the thermodynamic stability with structural elements, leading to specific molecular functionalities in vivo. Advancing our understanding of this association has helped the development of a series of applications in the fields of biotechnology, nanotechnology, the environment and health. In this Thesis, heat-induced as well as chemical denaturation is employed in order to accurately measure the thermodynamic stability of (a) lysozyme in solutions containing various concentrations of NaCl and Na₂SO₄, two salts that promote the crystallization of the molecules and of Li₂SO₄ and (NH₄)₂HPO₄, two salts that obstruct crystallization and (b) the catalytic domain of the psychrophilic chitinase-60, a (b/a)₈-barrel fold, which is of great importance in protein engineering mainly for its function in polymer hydrolysis. Both the thermal and the chemical denaturation explore the transition between the native, functional and fully folded state of the protein and the non-functional, denatured, partially or fully unfolded state. High-accuracy adiabatic differential scanning calorimetry, circular dichroism (CD) and fluorescence spectroscopy have all been used to systematically study the structural transitions. In the case of lysozyme in solution with crystallization-promoting salts, the thermodynamic stability is found to increase with the salt concentration, which can be directly attributed to the decreasing entropy of the native state. In this case the higher degree of organization of the native state in solution leads to a higher entropic-gain upon crystallization which is the driving force of the process. In the second part of the Thesis, the catalytic domain of chitinase-60 is shown to exhibit a thermodynamic autonomy as well as an extraordinary resistivity to chemical denaturants. The thermodynamic stability was measured ΔG~ 7 kcal/mol, while both thermal and chemical unfolding processes were characterized by high kinetic barriers. The (b/a)₈-barrel fold of chitinase-60 is thus found to exhibit a “plug-and-play-domain” profile which combined to its chemical resistivity establishes it as a very attractive molecule for biotechnological environmental applications.

Η συσχέτιση της θερμοδυναμικής σταθερότητας με τη δομή και την εξειδικευμένη λειτουργικότητα αποτελεί, τις τελευταίες δεκαετίες, μία από τις μεγαλύτερες ερευνητικές προκλήσεις στην επιστήμη των Πρωτεϊνών. Η κατανόηση αυτής της συσχέτισης πυροδοτεί την ανάπτυξη πλήθους εφαρμογών στη βιοτεχνολογία, στη νανοτεχνολογία, στο περιβάλλον και στην υγεία. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής, χρησιμοποιείται τόσο η θερμική όσο και η χημική μετουσίωση, για να διερευνηθεί η ενδεχόμενη συσχέτιση της θερμοδυναμικής σταθερότητας α) της πρωτεΐνης λυσοζύμη με τη συγκέντρωση των αλάτων NaCl και Na₂SO₄, που την κρυσταλλώνουν και των αλάτων, Li₂SO₄ και (NH₄)₂HPO₄, που δεν την κρυσταλλώνουν και β) με την εξαιρετικής σημασίας αρχιτεκτονική δίπλωσης, (βα)₈-βαρέλι της καταλυτικής περιοχής της πρωτεΐνης χιτινάση-60. Η μελέτη της θερμικής και η χημικής μετουσίωσης των πρωτεϊνών, δηλαδή η μετάβασή τους από τη φυσική, λειτουργική, διπλωμένη κατάσταση στη μη λειτουργική, μερικώς ή πλήρως ξεδιπλωμένη, πραγματοποιείται μέσω θερμιδομετρικών και φασματοσκοπικών τεχνικών. Αυτές συμπεριλαμβάνουν υψηλής ακρίβειας αδιαβατική θερμιδομετρία διαφορικής σάρωσης (DSC), φασματοπολωσιμετρία κυκλικού διχροϊσμού (CD) και φασματοσκοπία φθορισμού. Για τα άλατα που κρυσταλλώνουν τη λυσοζύμη διαπιστώθηκε αύξηση της θερμοδυναμικής σταθερότητας στις μεγαλύτερες συγκεντρώσεις, η οποία ενδεχομένως οφείλεται στην ελάττωση της εντροπίας της φυσικής κατάστασης της λυσοζύμης. Στην περίπτωση αυτή η μεγαλύτερη οργάνωση της φυσικής κατάστασης της λυσοζύμης αυξάνει το εντροπικό όφελος της κρυστάλλωσης. Η απελευθέρωση μορίων νερού από την πρωτεϊνική επιφάνεια θεωρείται η κύρια θερμοδυναμική καθοδηγητική τάση της κρυστάλλωσης. Η καταλυτική περιοχή της χιτινάσης-60 αποδείχθηκε μια αυτόνομη θερμοδυναμική οντότητα, η οποία επιδεικνύει μια εντυπωσιακή ανθεκτικότητα σε χημικούς αποδιατάκτες. Η θερμοδυναμική του σταθερότητα προσδιορίστηκε ΔG~ 7 kcal/mol. Η προοπτική αξιοποίησης του (βα)₈-βαρελιού της χιτινάσης-60 σε έναν ρόλο “plug and play” σε συνδυασμό με την εντυπωσιακή ανθεκτικότητά του σε χημικούς αποδιατακτές προσδίδει στην πρωτεϊνική αυτή περιοχή ελκυστικές ιδιότητες για περιβαλλοντικές και άλλες εφαρμογές.