Λειτουργική διάκριση των ισομορφών TAp73 στην ογκογένεση

Abstract

The p73 gene encodes the tumor suppressive full-length TAp73 and N-terminal-truncated DNp73 isoforms that act as dominant negative inhibitors of TAp73. The overall effect of p73 in oncogenesis is thought to depend on the TAp73 to DNp73 isoforms’ ratio. TAp73 isoforms include a number of C-terminal variants (namely TAp73α, TAp73β, TAp73γ, TAp73δ, TAp73ε, TAp73ζ and TAp73η) as a result of alternative splicing in 3′-end. TAp73 isoforms differ in their transcriptional activities, as estimated by their transactivation efficiency on typical p53 targets, such as the p21Waf 1/Cip1, a key component of cell cycle regulation. Each TAp73 isoform not only activates the same targets to a different extend, but it also seems to have distinct gene targets. Data on the most studied TAp73α and TAp73β isoforms clearly highlight that, at least these isoforms, have opposing effects on the same target genes and they can also transactivate different targets. A number of recent studies highlight physical properties, as well as specific functional domains and residues of C-terminal tail of TAp73 isoforms that enhance or impair their transcriptional activity and apoptotic efficiency. These are: a) The C-terminal electrostatic charge, b) the Glu/Pro-rich and Pro-rich regions, c) the PPPPY motif d) the SAM domain and extreme C terminus (17). Oncogenesis includes well defined steps, through which “successful” genetic changes offer a growth advantage to normal cells, leading to their progressive transformation into cancer cells, in a process analogous to Darwinian evolution. In 2000, Hanahan et al. reported six steps (or hallmarks) in this process, i.e. sustaining proliferative signaling, evading growth suppressors, activating invasion and metastasis, enabling replicative immortality, inducing angiogenesis and resisting cell death. In 2011, Hanahan et al. (1) added two more hallmarks in this crucial list, i.e. reprogramming of energy metabolism and evading immune destruction, as well as two enabling characteristics, i.e. tumor-promoting inflammation and genome instability. Strikingly, TAp73 isoforms inhibit all these hallmarks and enabling characteristics, thus drastically influencing processes that underlie cancer promotion, progression and metastasis.The discovery of microRNAs (miRNAs) and their link with cancer has opened a new era in cancer therapeutics. Approximately, 19 - 25 nucleotides long, miRNAs can up-regulate or down-regulate gene expression in many cancer types and are respectively categorized as oncogenes (oncomirs) or tumor suppressors. Expression proles of miRNAs with biomarker potential can be used for the classication, diagnosis, therapeutic treatment, and prognosis of different cancer types. miRNA mimics and miRNA antagonists are the two main approaches to miRNA-based cancer therapies. The aim of this study is the functional distinction of the TAp73 isoforms in carcinogenesis. The TAp73α, TAp73β and TAp73γ isoforms were evaluated for their ability to induce specific miRNA signatures and to elucidate the underlying mechanisms of the inhibition of cell proliferation, cell migration and cell invasion. p53 family members, such as p53 and p63, antagonize epithelial to mesenchymal transition (EMT) processes through crucial microRNAs (miRNAs) that down-regulate EMT markers. However, to date, there are no published reports on p73-induced miRNAs that suppress EMT. In this study we examined which miRNAs are directly induced by the TAp73α, TAp73β and TAp73γ isoforms and inhibit the hallmarks and enabling characteristics of cancer.Using wound healing assays and Western blot, we showed that TAp73 isoforms differentially inhibit cell migration in vitro and alter levels of prometastatic EMT markers. To test whether this effect is also miRNA-mediated, we searched for miRNAs that are directly upregulated upon TAp73 induction, using high-throughput approaches (miRNA Micro Arrays). We found that TAp73 isoforms transactivate miRNAs with putative EMT-related targets, namely the well-studied TAp73 target miR-34a-5p and the still uncharacterized miR-3158-5p. miR-3158-5p was further identified as a direct TAp73 target, using ChIP and luciferase assays. It also down-regulates the EMT marker vimentin and inhibits cancer cell proliferation, migration and invasiveness in vitro. miR-3158-5p is under-expressed in breast cancer cell lines with high proliferation and invasive potential compared to breast cancer cell lines with low proliferation and invasive potential. MDA-MB-231 and MDA-MB-468 stably transfected clones expressing MIR3158 were constructed. These breast cancer cell lines are highly invasive. The inhibition of cell proliferation, colony formation, migration and invasion in these expressing MIR3158 clones was established by proliferation assay, colony formation assay, wound healing assay and invasion assay, respectively. In vivo zenografts were performed in SCID mice using MDA-MB-231 and MDA-MB-468 stably transfected clones and the anti-proliferative effect of MIR3158 was evaluated by measuring the volumes of the tumors that were formed during the experiment compared to the corresponding negative control mock clones. Furthermore, using bioinformatics tools we managed to identify and characterize the homologous mouse MIR3158 gene. This so called mmu-miR-3158Like gene was cloned into an expression vector and A5 skin cancer mouse cells we transiently transfected. We managed to identify two novel mouse mature miRNAs, namely mmu-miR-3158L-1 and mmu-miR-3158L-2. Finally, using bioinformatics tools we managed to predict that these mature mouse miRNAs directly target the mRNA of mouse vimentin and we showed that the expression levels of mouse vimentin were diminished upon the expression of the novel mouse MIR3158Like gene.

Το γονίδιο p73, μαζί με το p63, ανήκει στην οικογένεια του γονιδίου p53. Συνθέτει μια πληθώρα ισομορφών, οι οποίες κατατάσσονται σε δυο ομάδες, τις ογκοκατασταλτικές ΤΑ ισομορφές που επάγονται από τον P1 υποκινητή και περιλαμβάνουν την ΤΑ περιοχή, και τις ογκογόνες DN ισομορφές οι οποίες επάγονται από τον εσωτερικό P2 υποκινητή. Η ισορροπία μεταξύ των ισομορφών αυτών μπορεί να καθορίσει και την μοίρα του κυττάρου. Οι ισομορφές ΤΑp73 περιλαμβάνουν ένα αριθμό παραλλαγών (TAp73α, TAp73β, TAp73γ, TAp73δ, TAp73ε, TAp73ζ and TAp73η) που παράγονται λόγω του εναλλακτικού ματίσματος στο καρβοξυτελικό άκρο. Οι ισομορφές ΤΑp73 διαφέρουν ως προς την μεταγραφική τους δραστηριότητα, όπως προκύπτει από την αποτελεσματικότητά τους να ενεργοποιούν ένα κλασσικό στόχο του γονιδίου p53, το p21Waf 1/Cip1, που αποτελεί έναν σημαντικό στοιχείο της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου. Κάθε μία από τις ισομορφές ΤΑp73 όχι μόνο ενεργοποιεί σε διαφορετικό βαθμό τα ίδια γονίδια, αλλά φαίνεται να διαθέτουν διακριτούς μεταγραφικούς στόχους. Στοιχεία για τις πιο μελετημένες ισομορφές (TAp73α και TAp73β) τονίζουν σαφώς ότι, τουλάχιστον αυτές οι ισομορφές, έχουν αντίθετες επιδράσεις στα ίδια γονίδια-στόχους και μπορούν επίσης να ενεργοποιούν μεταγραφικά διαφορετικούς στόχους. Μια σειρά πρόσφατων μελετών τονίζουν φυσικές ιδιότητες, καθώς και συγκεκριμένες λειτουργικές περιοχές και τα αμινοξικά κατάλοιπα της καρβοξυτελικής ουράς των TAp73 ισομορφών που ενισχύουν ή εμποδίζουν την μεταγραφική δραστηριότητα και την αποπτωτική αποτελεσματικότητά τους. Αυτές οι α) το ηλεκτροστατικό φορτίο της καρβοξυτελικής περιοχής, β) οι περιοχές πλούσιες σε Pro και Glu/Pro, γ) το μοτίβο PPPPY και δ) η περιοχή SAM και η έσχατη καρβοξυτελική περιοχή (17).Η ογκογένεση περιλαμβάνει σαφώς καθορισμένα στάδια, μέσω των οποίων «επιτυχημένες» γενετικές αλλαγές προσφέρουν πλεονέκτημα ανάπτυξης σε φυσιολογικά κύτταρα, οδηγώντας τα στην προοδευτική μετατροπή τους σε καρκινικά κύτταρα. Το 2000, οι Hanahan και Weinberg ανέφεραν ορόσημα σε αυτή τη διαδικασία, δηλαδή τη διατήρηση πολλαπλασιαστικής σηματοδότησης, την καταστρατήγηση αναστολέων ανάπτυξης, την ενεργοποίηση της διείσδυσης και της μετάστασης, την απόκτηση ικανότητας αθανατοποιημένου διπλασιασμού, την επαγωγή της αγγειογέννεσης και την αντίσταση στον κυτταρικό θάνατο. Το 2011, οι ίδιοι επιστήμονες προσέθεσαν δύο ακόμη ορόσημα σε αυτή την σημαντική λίστα, δηλαδή τον επαναπρογραμματισμό του ενεργειακού μεταβολισμού και την καταστρατήγηση της καταστροφής από το ανοσοποιητικό σύστημα, καθώς και δύο νέα χαρακτηριστικά, δηλαδή την φλεγμονή που προάγει δημιουργία όγκου και τη γονιδιωματική αστάθεια. Είναι εντυπωσιακό ότι, οι ισομορφές TAp73 αναστέλλουν όλα αυτά τα ορόσημα και χαρακτηριστικά γνωρίσματα του καρκίνου, επηρεάζοντας δραστικά τις διαδικασίες που διέπουν την προώθηση του καρκίνου, την εξέλιξη και τη μετάσταση.Η ανακάλυψη των microRNAs (miRNAs) και της σχέσης τους με τον καρκίνο έχει ανοίξει μια νέα εποχή στη θεραπευτική προσέγγιση του καρκίνου. Τα miRNAs είναι μια ομάδα μικρών, μονόκλωνων στην ώριμη μορφή τους, μορίων RNAs μήκους 16-25 νουκλεοτίδια και συμμετέχουν στην αρνητική ρύθμιση πολλών γονιδίων. Πρότυπα έκφρασης των miRNAs θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες για την ταξινόμηση, τη διάγνωση, τη θεραπευτική αγωγή, και την πρόγνωση των διαφορετικών τύπων του καρκίνου του ανθρώπου. Χρήση των μιμητικών μορίων miRNA και ανταγωνιστών των miRNA είναι οι δύο κύριες προσεγγίσεις για θεραπεία του καρκίνου με βάση τα miRNAs. Ο σκοπός της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της λειτουργικής διάκρισης των ισομορφών TAp73 του γονιδίου p73 κατά την ογκογένεση. Προκειμένου να επιτευχθεί αυτός ο στόχος μελετήθηκαν οι ισομορφές TAp73α, TAp73β και TAp73γ ως προς: τις διαφορές στις λειτουργικές περιοχές και τα λειτουργικά κατάλοιπα που περιλαμβάνει η κάθε μία ισομορφή, το μεταγραφικό πρότυπο έκφρασης των miRNAs που επάγουν και την ικανότητά τους, καθώς και οι μηχανισμοί που εμπλέκονται, να αναστέλλουν ορισμένα ορόσημα του καρκίνου όπως ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, η επιθηλιο-μεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΤ) και η κυτταρική κινητικότητα και διείσδυση. Έχει εκτενώς αναφερθεί στην βιβλιογραφία ότι τα δυο άλλα μέλη της οικογένειας του p53 επάγουν ορισμένα miRNAs, τα οποία με τη σειρά τους αναστέλλουν γονίδια σχετιζόμενα με το ΕΜΤ. Ο σκοπός της μελέτης ήταν να εντοπίσουμε, να ταυτοποιήσουμε και να χαρακτηρίσουμε αντίστοιχα miRNAs για το τρίτο μέλος της οικογένειας, το p73.Κάνοντας χρήση της δοκιμασίας επούλωσης πληγής και της ανοσοστύπωσης κατά Western, παρατηρήσαμε ότι οι ισομορφές TAp73 αναστέλλουν διαφορικά την μετανάστευση των κυττάρων in vitro και ρυθμίζουν αρνητικά πρωτεϊνικούς δείκτες σχετιζόμενους με την ΕΜΤ, όπως η zeb1, snail και η βιμεντίνη. Προκειμένου να ελεγχθεί αν αυτή η επίδραση είναι miRNA διαμεσολαβούμενη, αναζητήσαμε miRNAs που υπερεκφράζονται άμεσα μετά από επαγωγή των ισομορφών TAp73 κάνοντας χρήση της τεχνολογίας των μικροσυστοιχειών των miRNAs. Αποκαλύψαμε ότι οι ισομορφές TAp73 ενεργοποιούν μεταγραφικά miRNAs τα οποία δυνητικά στοχεύουν παράγοντες σχετιζόμενους με την ΕΜΤ, το ευρέως μελετημένο miR-34a-5p και το, έως τώρα, αχαρακτήριστο miR-3158-5p. Το miR-3158-5p περαιτέρω ταυτοποιήθηκε ως άμεσος στόχος των ισομορφών TAp73 κάνοντας χρήση της δοκιμασίας της ανοσοκατακρύμνισης χρωματίνης (ChIP assay) και της δοκιμασίας λουσιφεράσης. Επιπλέον, ρυθμίζει αρνητικά την βιμεντίνη, έναν σημαντικό δείκτη της ΕΜΤ, και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου, τη μετανάστευση και διεισδυτικότητα in vitro. Το miR-3158-5p είναι υπό-εκφρασμένο σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού με υψηλό δυναμικό πολλαπλασιασμού και διείσδυσης σε σύγκριση με καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού με χαμηλό δυναμικό πολλαπλασιασμού και διείσδυσης. Κατασκευάστηκαν σταθερά διαμολυμένοι κλώνοι των κυτταρικών σειρών MDA-MB-231 και MDA-MB-468 οι οποίοι εξέφραζαν σταθερά το γονίδιο του MIR3158. Αυτές οι κυτταρικές σειρές του καρκίνου του μαστού είναι ιδιαίτερα διεισδυτικές. Σε όλους τους κλώνους και των δυο κυτταρικών σειρών που εξέφραζαν το MIR3158 παρατηρήσαμε πτώση στην ικανότητα πολλαπλασιασμού και την ικανότητα σχηματισμού αποικιών των κλώνων, συγκριτικά με τους αντίστοιχους αρνητικούς μάρτυρες. Ομοίως, σε in vivo πειράματα παρατηρήθηκε η αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του γονιδίου MIR3158 σε όλους τους κλώνους και των δυο κυτταρικών σειρών, μετά από 11 βδομάδες που διήρκησε η πειραματική διαδικασία. Επιπλέον, κάνοντας χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής, καταφέραμε να προσδιορίσουμε και να χαρακτηρίσουμε το ομόλογο γονίδιο MIR3158 στο ποντίκι. Ονομάσαμε το γονίδιο αυτό MIR3158Like, το οποίο και κλωνοποιήσαμε σε έναν φορέα έκφρασης και διαμολύναμε κύτταρα καρκινικής σειράς Α5 του ποντικού. Καταφέραμε να προσδιορίσουμε δύο νέα ώριμης μορφής miRNAs στο ποντίκι, δηλαδή mmu-miR-3158L-1 και mmu -miR-3158L-2. Τέλος, με τη χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής καταφέραμε να προβλέψουμε ότι αυτά τα ώριμα miRNAs του ποντικού στοχεύουν άμεσα το mRNA της βιμεντίνης ποντικιού και δείξαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης της βιμεντίνης του ποντικού μειώθηκαν μετά την έκφραση του νέου γονιδίου MIR3158Like του ποντικού.