Προϊόντα προστιθέμενης αξίας με βάση την μονοκυτταρική πρωτεΐνη από βιοτεχνολογική αξιοποίηση μικτών αποβλήτων της βιομηχανίας τροφίμων

Abstract

The aim of the thesis was the development of a methodology for biotechnological utilization of mixed solid and liquid wastes of food industries (brewing, dairy and sugar industries), restaurants and landfills for the production of added-value products. Specifically, the wastes that were evaluated were brewer’s spent grains (BSG), malt spent rootlets (MSR), cheese whey, molasses, orange and potato pulps. The utilization of mixed food industry wastes for added-value products based on SCP, was studied using four microorganisms: the alcohol resistant and cryotolerant strain S. cerevisiae AXAZ-1, the thermotolerant strain K. marxianus IMB3, the natural mixed culture kefir and the edible mushroom P. ostreatus). Firstly, the composition of the raw materials was analyzed and specifically, moisture and dry matter, protein, fermentable sugar, fat and nutrient minerals content, C.O.D, phenolic compounds and antioxidant capacity. Moreover, the wastes were analyzed for their headspace aroma volatiles by SMPE GC/MS. All wastes had significant amounts of fermentable and protein. Also, all wastes had high C.O.D values, indicating their high pollution potential. In addition, all wastes, had high concentrations of phenolic compounds, including cheese whey. Nevertheless, their antioxidant capacity was negligible. The nutrient minerals concentration of the wastes was also high, with magnesium being the major element found. Finally, the wastes were rich in headspace aroma compounds.Concequantly, the use of mixed agro-industrial wastes as substrates for SCP production by submerged (SmF) and solid state fermentation (SSF), using S. cerevisiae AXAZ-1, K. marxianus ΙΜΒ3, kefir and P. ostreatus was studied. The substrate that gave the highest S. cerevisiae biomass yield by SmF consisted of 100 mL orange pulp, 50 mL molasses and 50 mL deionized water, and by SSF it had the same composition plus 70 g BSG. The optimum conditions for SCP production by S. cerevisiae were 30 oC and pH 5.5. For SCP production using K. marxianus the optimum substrate for SmF was 100 mL orange pulp, 30 mL whey, 10 mL molasses, 10 mL potato pulp and 50 mL deionized water and for SSF it also contained 80 g BSG. The optimum conditions for SCP production were 30 oC and pH 7. The substrate that gave the highest kefir biomass yield by SmF was 100 mL whey, 30 mL orange pulp, 10 mL molasses, 10 mL potato pulp and 50 mL deionized water and for SSF it had the same composition plus 60 g BSG and 25 g MSR. The optimum conditions for kefir SCP production were 30 oC and pH 5.5. Finally, the substrate for which the highest sugar consumption, highest protein increase and mycelium yield of P. ostreatus were observed, was 20 mL molasses, 20 mL potato pulp, 5 mL whey, 5 mL orange pulp, 30 g BSG and 5 g MSR. The optimum conditions for P. ostreatus mycelium growth were 25 oC and pH 4. In all cases, orange pulp and BSG seemed to act as promoting materials for SCP production, increasing the biomass yields. Furthermore, the growth of the edible mushroom P. ostreatus in the optimum substrate was studied, using three types of bioreactors (shallow tray-type, tower-type and polyethylene bags) that were filled with 1Kg sterilized substrate and left for incubation at 25 oC. After 40 days, no sign of carpophores was detected. All the treated substrates were evaluated as food or animal feed by analysis of their composition. High protein, fat and minerals contents were found. Also, a lot of headspace volatile compounds were detected, with distinct aromas, mainly fruity. The treated substrates, after autolysis and freeze-drying, were also evaluated as yeast extract for S. cerevisiae growth in glucose synthetic medium. For comparison, commercial yeast extract was used. Three concentrations of each extract were used (0.3, 0.4 and 0.5% w/v) and the biomass that was produced after 48 h was determined by measurement of the optical density and by weighing after harvesting by centrifugation. The extracts of the treated substrates by SmF performed better than the commercial yeast extract, giving highest biomass productivity in all concentrations. As for the extracts of the SSF products, only the K. marxianus extract was better than the commercial at the studied concentrations. On the other hand, the kefir extract was worse than the commercial yeast extract at all concentrations.Finally, the treated substrates were also analyzed for their RNA content to evaluate their use as extracts for flavour enhancement in carrot soups compared with sea salt and monosodium glutamate (MSG). The RNA content of all the treated materials was high with the highest values detected in the SSF products. Afterwards, the extracts were added in carrot soup at 0.5% w/w concentration and two soups were also prepared with salt and MSG addition at the same concentration. The soups were given for evaluation to six non-trained judges who gave a mark to the products based on a preference 1-10 scale (10= perfect, 8= very good, 7= good, 6= moderate, 5= indifferent, 3= bad and 1= very bad). The judges gave the higher mark to the soups that contained MSG, K. marxianus SSF product, and salt, while all the other soups got lower marks. Additionally, volatile compounds were analyzed by headspace SPME GC/MS and higher concentrations were observed in soups that contained the SCP-based extracts than MSG. However, their volatile concentrations were lower than that of the soup with salt. So it seems that MSG can be successfully replaced by the SCP-based extracts and the symptoms of “Chinese Restaurant Syndrome”, that MSG has been accused for, can be avoided

Στόχος της διατριβής ήταν η ανάπτυξη μιας ολοκληρωμένης μεθοδολογίας βιοτεχνολογικής αξιοποίησης μικτών στερεών και υγρών αποβλήτων της βιομηχανίας τροφίμων (ζύθου, γάλακτος, ζάχαρης), μαζικής εστίασης ή χωματερών για την παραγωγή προϊόντων προστιθέμενης αξίας. Συγκεκριμένα τα απόβλητα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι φλοιοί και τα ριζίδια βύνης (BSG και MSR αντίστοιχα), το τυρόγαλα, η μελάσσα και οι πούλπες πορτοκαλιού και πατάτας. Έτσι, μελετήθηκε η χρήση μικτών αποβλήτων της βιομηχανίας τροφίμων για την παραγωγή προϊόντων προστιθέμενης αξίας με βάση την SCP, χρησιμοποιώντας τέσσερεις μικροοργανισμούς, το αλκοολανθεκτικό και κρυοανθεκτικό στέλεχος Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1, το θερμόφιλο στέλεχος Kluyveromyces marxianus, τη φυσική μικτή καλλιέργεια κεφίρ και το εδώδιμο μανιτάρι Pleurotus ostreatus. Αναλυτικότερα, αρχικά αναλύθηκε η σύσταση των αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων ως προς την υγρασία τους, τα ξηρά συστατικά, την πρωτεΐνη και τα σάκχαρα που αυτά περιέχουν, το λίπος, το C.O.D. καθώς και τα φαινολικά συστατικά αλλά και την αντιοξειδωτική ικανότητα που αυτά διαθέτουν. Επιπλέον, τα 6 απόβλητα αναλύθηκαν ως προς την περιεκτικότητά τους σε μέταλλα και αρωματικά συστατικά. Και τα 6 απόβλητα περιείχαν σημαντική ποσότητα σακχάρου αλλά και πρωτεΐνης. Επίσης, όλα τα απόβλητα είχαν υψηλό C.O.D, κάτι που αποδεικνύει το πόσο σημαντικοί ρύποι είναι τα συγκεκριμένα απόβλητα. Επίσης περιείχαν σημαντική συγκέντρωση φαινολικών συστατικών, ακόμη και το τυρόγαλα για το οποίο ήταν κάτι αξιοσημείωτο. Παρόλα αυτά, η αντιοξειδωτική τους ικανότητα ήταν μηδαμινή. Το περιεχόμενο των αποβλήτων σε μέταλλα ήταν αρκετά υψηλό με κύριο συστατικό το μαγνήσιο. Τέλος, τα 6 απόβλητα ήταν πλούσια σε πτητικά συστατικά όπως αυτά προσδιορίστηκαν με ανάλυση headspace SPME GC/MS. Επίσης, μελετήθηκε η χρήση μικτών αποβλήτων ως υποστρώματα παραγωγής SCP με ζυμώσεις υγρής (SmF) και στερεάς κατάστασης (SSF) χρησιμοποιώντας τους μικροοργανισμούς, S. cerevisiae AXAZ-1, K. marxianus ΙΜΒ3, κεφίρ και P. ostreatus. Το υπόστρωμα που παρείχε την μεγαλύτερη απόδοση βιομάζας (g βιομάζας/ g καταναλωθέντος σακχάρου) S. cerevisiae AXAZ-1 μέσω υγρής ζύμωσης ήταν 100 mL πούλπα πορτοκαλιού, 50 mL μελάσσα 4 οBe και 50 mL νερό ενώ για την ζύμωση στερεάς κατάστασης οι ίδιες ποσότητες με την προσθήκη 70 g BSG. Οι βέλτιστες συνθήκες παραγωγής SCP ήταν θερμοκρασία 30 οC και pH 5,5. Όσον αφορά τον K. marxianus, το βέλτιστο υπόστρωμα παραγωγής SCP ήταν 100 mL πούλπα πορτοκαλιού, 30 mL τυρόγαλα, 10 mL μελάσσα, 10 mL πούλπα πατάτας και 50 mL νερό για υγρή ζύμωση, ενώ για την στερεή το βέλτιστο υπόστρωμα περιείχε και 80 g BSG. Οι βέλτιστες συνθήκες παραγωγής SCP ήταν 30 οC και pH 7. Το υπόστρωμα που παρείχε την μεγαλύτερη απόδοση βιομάζας κεφίρ ήταν 100 mL τυρόγαλα, 30 mL πούλπα πορτοκαλιού, 10 mL μελάσσα, 10 mL πούλπα πατάτας και 50 mL νερό, όσον αφορά την υγρή ζύμωση, ενώ για την στερεή ζύμωση προστέθηκαν 60 g BSG και 25 g MSR. Οι βέλτιστες συνθήκες παραγωγής SCP ήταν θερμοκρασία 30 οC και pH 5,5. Όσον αφορά τον μύκητα P. ostreatus το υπόστρωμα το οποίο παρείχε την μεγαλύτερη κατανάλωση σακχάρου και ταυτόχρονα αύξηση της περιεχόμενης πρωτεΐνης αλλά και μεγαλύτερη απόδοση μυκηλίου ήταν 20 mL μελάσσα, 20 mL πούλπα πατάτας, 5 mL τυρόγαλα, 5 mL πούλπα πορτοκαλιού, 30 g BSG και 5 g MSR. Οι βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης μυκηλίου ήταν θερμοκρασία 30 οC και pH 4. Σε όλες τις περιπτώσεις παραγωγής SCP διαπιστώθηκε πως η πούλπα πορτοκαλιού και τα BSG είχαν την δράση προωθητή της παραγωγής SCP. Ακόμη, μελετήθηκε η παραγωγή εδώδιμών μανιταριών P. ostreatus με χρήση τριών τύπων αντιδραστήρων (σακούλα πολυαιθυλενίου, αλουμινένια οριζόντια δοχεία, κάθετοι πλαστικοί αντιδραστήρες) οι οποίοι συμπληρώθηκαν με 1 Kg αποστειρωμένου μικτού στερεού υποστρώματος και στη συνέχεια αφέθηκαν για επώαση στους 25 οC. Μετά το πέρας 40 ημερών δεν διαπιστώθηκε εμφάνιση καρποφοριών. Ακόμη, οι SCP που παράχθηκαν μέσω ζύμωσης μικτών αποβλήτων αξιολογήθηκαν ως τρόφιμο ή ζωοτροφή, αναλύοντας την ποιότητά τους. Παρουσίασαν υψηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη, λίπος και μέταλλα, συστατικά που είναι σημαντικά τόσο για την ανθρώπινη διατροφή όσο και για την διατροφή των ζώων. Επίσης, περιείχαν αρκετά πτητικά συστατικά, που προσέδιδαν ιδιαίτερο άρωμα, κυρίως φρούτων. Η παραγόμενες SCP στη συνέχεια υπέστησαν αυτόλυση και λυοφιλίωση και αξιολογήθηκαν ως εκχύλισμα μικροβιολογίας για την ανάπτυξη βιομάζας S. cerevisiae AXAZ-1 σε συνθετικό θρεπτικό γλυκόζης. Επίσης, για σύγκριση χρησιμοποιήθηκε εμπορικό yeast extract. Τα εκχυλίσματα και το εμπορικό yeast extract χρησιμοποιήθηκαν σε τρείς συγκεντρώσεις (0,3%, 0,4% και 0,5% w/v) και η βιομάζα που παράχθηκε μετά από 48 h ζύμωσης προσδιορίστηκε με προσδιορισμό της οπτικής πυκνότητας με τη βοήθεια πρότυπης καμπύλης απορρόφησης αλλά και σταθμικά μετά από φυγοκέντριση. Τα εκχυλίσματα SCP από υγρές ζυμώσεις αποδείχτηκαν καλύτερα από το εμπορικό yeast extract δίνοντας μεγαλύτερη παραγωγικότητα βιομάζας σε όλες τις συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν. Όσον αφορά τα εκχυλίσματα SCP από στερεές ζυμώσεις μόνο αυτό του K. marxianus ήταν καλύτερο σε όλες τις συγκεντρώσεις από το εμπορικό. Αντίθετα, το εκχύλισμα κεφίρ SSF ήταν χειρότερο από το εμπορικό σε όλες τις συγκεντρώσεις που μελετήθηκε.Τέλος, μελετήθηκε η περιεκτικότητα της SCP σε RNA, έτσι ώστε τα εκχυλίσματα SCP να χρησιμοποιηθούν στη συνέχεια ως ενισχυτικό γεύσης σε σούπες καρότου σε σύγκριση με αλάτι και γλουταμινικό μονονάτριο. Η περιεκτικότητα σε RNA ήταν πολύ υψηλή (264-1400 mg/100 g ξηρής SCP) με τις υψηλότερες τιμές να προσδιορίζονται στις SCP από στερεή ζύμωση. Στη συνέχεια τα εκχυλίσματα προστέθηκαν σε σούπα καρότου σε συγκέντρωση 0,5% w/w και σε ίδια ποσότητα προστέθηκαν σε δύο ακόμη σούπες αλάτι και γλουταμινικό νάτριο, αντίστοιχα. Οι σούπες δόθηκαν σε έξι κριτές για αξιολόγηση οι οποίοι βαθμολόγησαν τις σούπες με βάση μια κλίμακα προτίμησης 1-10 (10= Άριστη, 8= Πολύ καλή, 7= Καλή, 6= Μέτρια, 5= Αδιάφορη, 3= Κακή και 1= Πολύ κακή). Οι κριτές βαθμολόγησαν υψηλότερα τις σούπες που περιείχαν γλουταμινικό νάτριο, εκχύλισμα K. marxianus από στερεή ζύμωση και αλάτι ενώ όλες οι άλλες σούπες βαθμολογήθηκαν πιο χαμηλά. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε ανάλυση των αρωματικών ενώσεων με GC/MS όπου διαπιστώθηκε πως οι σούπες που περιείχαν εκχυλίσματα SCP ως ενισχυτικό γεύσης περιείχαν μεγαλύτερη συγκέντρωση πτητικών ενώσεων από αυτή με γλουταμινικό. Έτσι, φαίνεται πως το γλουταμινικό νάτριο μπορεί να αντικατασταθεί επιτυχώς από τα εκχυλίσματα μονοκυτταρικής πρωτεΐνης και έτσι να εξαλειφθούν τα «συμπτώματα του Kινέζικου εστιατορίου» για τα οποία έχει κατηγορηθεί