Πυρηνο-κυτταροπλασματική κυκλοφορία σε ασύμμετρα διαιρούμενα βλαστικά κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος: πιθανός ρόλος στην παθογένεση της λευχαιμίας

Abstract

Asymmetric cell division (ACD) is a unique mode of division, which generates two distinct daughter cells. The use of ACDs enables the conservation of a subpopulation at an inferior developmental state (closer to pluripotency) compared to the rest neighboring cells, contributing to the embryonic development and homeostasis during adulthood. However, bibliographically, the use of ACD by stem cells (SCs) under in vitro culturing conditions allows multiple interpretations, maintaining its contribution to the heterogeneity that characterizes SC-differentiation unclear. The present work attempted to clarify if ACDs are utilized in vitro, using a range of differentiable cellular systems (leukemic cell lines and relevant patient samples and mouse embryonic SCs -ESCs). These differentiations were thoroughly investigated for the presence of ACDs using a wide range of classical ACD markers. Additionally, the distribution (symmetric-asymmetric) of other factors e.g. pluripotency factors, nucleoporins or template DNA were also explored.The consistent result of the above analysis favors the use of symmetric cell divisions by the in vitro differentiating cells. This symmetry was also evident in the quantitative-qualitative analysis of the nuclear envelope composition within daughter cell pairs. However, structural and mobility asymmetries were recorded in the mitotic spindles of self-renewing ESC divisions. As a consequence of all the above results, an alternative explanation was pursued. Initially, we investigated the possibility of differential fate acquisition by daughter cells, through the unequal activation of primary cilia (pc) mediated signaling like Hedgehog. This was conducted once it was verified that in vitro-ESCs assemble pc that emerge asynchronously between daughter cells. This analysis revealed that the Hedgehog signaling pathway is inactive in both self-renewing and early differentiating ESCs. Thus, the contribution of cell sorting to the observed heterogeneity of ESC differentiation was investigated. Towards this direction, a series of experiments was conducted including co-cultures and chimeric differentiations of mixed cellular populations comprised of parental E14 cells and clones of them that overexpress distinct parts of the LBR gene. These experiments highlighted that the dynamic process of cell sorting between ESCs of differential developmental potential contributes decisively to the allocation of a cell (within a colony or embryoid body), its transcriptional activity and the final outcome (efficiency) of the differentiation in a context-dependent manner (composition of the initial mixture of cells and growth medium).Collectively, we anticipate that the heterogeneity of an in vitro differentiation cannot be attributed to ACDs or the asynchronous pc’s mediated signaling but to the dynamic process of cell sorting. Finally, according to the results of this dissertation, both the “unusual” moves of the mitotic spindle (during anaphase) and the absence of Hedgehog activity in self-renewing ESCs could potentially be suggested as candidate markers of pluripotency.

Η ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση (ΑΚΔ) αποτελεί ένα ιδιαίτερο τύπο κυτταρικής διαίρεσης όπου, υπό μια εξαιρετικά συντηρημένη διαδικασία, προκύπτουν δυο διακριτά θυγατρικά κύτταρα. Με τη χρήση ΑΚΔ διατηρείται ένας υποπληθυσμός κυττάρων σε υποδεέστερο αναπτυξιακό επίπεδο (πιο βλαστικό) απ’ ότι τα γειτονικά κύτταρα συμβάλλοντας στην εμβρυονική ανάπτυξη ή την ομοιόσταση κατά την ενήλικη ζωή. Βιβλιογραφικά ωστόσο, η in vitro χρήση ΑΚΔ επιδέχεται πολλαπλών ερμηνειών, διατηρώντας ασαφή τη συνεισφορά της στην ετερογένεια που χαρακτηρίζει τις εν λόγω διαφοροποιήσεις.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή επιχειρήθηκε η αποσαφήνιση της παρουσίας ΑΚΔ σε μια σειρά διαφοροποιήσιμων κυτταρικών συστημάτων (λευχαιμικές κυτταρικές σειρές, νωπά δείγματα αντίστοιχων ασθενών και εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα (ΕΒΚ) ποντικού). Στις διαφοροποιήσεις των κυττάρων αυτών πραγματοποιήθηκε ενδελεχής έλεγχος των κλασσικών δεικτών για όλα τα στάδια μιας ΑΚΔ. Επιπλέον, διερευνήθηκαν και άλλοι παράγοντες ως προς την συμμετρική ή ασύμμετρη κατανομή τους λ.χ. δείκτες πολυδυναμίας, νουκλεοπορίνες και εκμαγείο DNA.Το στερεότυπο αποτέλεσμα που προέκυψε από όλα τα παραπάνω συστήματα και τις συνθήκες μελέτης ήταν η χρήση αποκλειστικά συμμετρικών διαιρέσεων από τα in vitro διαφοροποιούμενα κύτταρα. Η παραπάνω συμμετρία διατηρήθηκε και στην ποιοτική-ποσοτική ανάλυση της σύστασης των πυρηνικών φακέλων σε ζεύγη θυγατρικών κυττάρων. Παρόλα αυτά, καταγράφηκαν πρωτότυπες ασυμμετρίες στη δομή και τις κινήσεις της μιτωτικής ατράκτου σε αδιαφοροποίητα ΕΒΚ.Ως επακόλουθο των παραπάνω αποτελεσμάτων προέκυψε η αναζήτηση εναλλακτικής ερμηνείας διερευνώντας αρχικά την πιθανότητα ανάκτησης διαφορετικής κυτταρικής τύχης μεταξύ θυγατρικών κυττάρων μέσω της ετερόχρονης ενεργοποίησης σηματοδοτικών μονοπατιών από τις πρωταρχικές τους βλεφαρίδες (ΠΒ). Η ανάλυση αυτή πραγματοποιήθηκε στα ΕΒΚ, αφού πρώτα ταυτοποιήθηκε η παρουσία αλλά και ο ετερόχρονος σχηματισμός ΠΒ σε ζεύγη αδελφών κυττάρων. Ωστόσο, διαπιστώθηκε ότι οι ΠΒ των αδιαφοροποίητων ή πρώιμα διαφοροποιημένων ΕΒΚ δεν χρησιμοποιούνται (τουλάχιστον από το σηματοδοτικό μονοπάτι Hedgehog). Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η επίδραση του κυτταρικού διαχωρισμού στην ετερογένεια των διαφοροποιήσεων των ΕΒΚ. Πραγματοποιήθηκε μια σειρά πειραμάτων συγκαλλιέργειας και χιμαιρικών διαφοροποιήσεων μεταξύ πατρικών ΕΒΚ και μεταλλαγμένων, ως προς διάφορες μορφές του γονιδίου LBR, κλώνων αυτών. Τα πειράματα αυτά ανέδειξαν ότι η δυναμική διαδικασία του κυτταρικού διαχωρισμού μεταξύ ΕΒΚ με διαφορετικό αναπτυξιακό δυναμικό ή/και μεμβρανική τάση συνεισφέρει καταλυτικά στη θέση που καταλαμβάνει ένα κύτταρο σε μια καλλιέργεια (αποικία ή εμβρυονικό σωμάτιο), τη μεταγραφική του δραστηριότητα αλλά και το τελικό αποτέλεσμα (απόδοση) μιας διαφοροποίησης εξαρτώμενο από το αρχικό περιβάλλον (σύσταση αρχικού μείγματος κυττάρων και καλλιεργητικό μέσο). Συγκεντρωτικά, διαπιστώθηκε ότι η ετερογένεια που παρατηρείται στις in vitro διαφοροποιήσεις ΕΒΚ δεν μπορεί να αποδοθεί σε ΑΚΔ ή στην ασύγχρονη σηματοδότηση των ΠΒ, αλλά στην δυναμική διαδικασία του κυτταρικού διαχωρισμού. Τέλος, από τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας διαπιστώθηκε ότι οι ιδιαίτερες κινήσεις της αναφασικής ατράκτου και η απουσία της σηματοδότησης Hedgehog από τα αδιαφοροποίητα ΕΒΚ μπορούν να προταθούν ως πιθανοί εναλλακτικοί δείκτες βλαστικότητας των in vitro καλλιεργούμενων ΕΒΚ.