The role of NER factors in development and the physiology of the mouse

Abstract

Inborn mutations in genes of the Nucleotide Excision Repair (NER) pathway are known to be associated with syndromes showing clinical features with severe developmental abnormalities. However, little is known about the functional role of NER factors in mammalian development. Using a new knock-in mouse model expressing the NER structure-specific endonuclease XPF fused with a FTA-tag that gets specifically biotinylated by the bacterial ligase BirA, we performed pull-down experiments followed by mass spectrometry (MS) to isolate and characterize NER-associated protein complexes during postnatal murine development. We identified 140 XPF-bound core proteins that were common between three replicate experiments. By analyzing the MS data and verifying the interactions by co-immunoprecipitation, we were able to characterize a new protein complex that consists of ERCC1-XPF, CTCF, SMC1A, SMC3 and MBD2. Ablation of Ercc1 or exposure to DNA-damage agents causing intra-stand crosslinks (ICLs) triggers the localization of CTCF to heterochromatin regions in the nucleus and the dissociation of CTCF, SMC1A, SMC3 and ATRX from promoters and imprinting control regions (ICRs) of imprinted genes. In line with these findings, we also observe altered histone post-translational modification (PTMs) marks and the recruitment of RNAPII and basal transcription factors on promoters of imprinted genes. As a result Ercc1 depleted mice show aberrant developmental expression of a subset of imprinted genes without the DNA methylation status of their ICRs being affected. This response is cell-autonomous and requires signaling by ATM. We propose that ERCC1-XPF binds CTCF, SMC1A, SMC3 and MBD2 to form a complex required for the developmental silencing of imprinted genes and that persistent DNA damage signaling triggers chromatin changes that affect gene expression programs associated with NER developmental disorders.

Έμφυτες μεταλλάξεις σε γονίδια του μονοπατιού επιδιόρθωσης εκτομής νουκλεοτιδίων (NER) είναι γνωστό ότι σχετίζονται με σύνδρομα που φέρουν σοβαρές αναπτυξιακές ανωμαλίες. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τον λειτουργικό ρόλο των παραγόντων του NER μονοπατιού στην ανάπτυξη των θηλαστικών. Χρησιμοποιώντας ένα νέο knock-in μοντέλο ποντικού που εκφράζει την XPF ενδονουκλεάση συντηγμένη με ένα FTA-tag το οποίο βιοτινυλιώνεται ειδικά από την βακτηριακή λιγάση ΒirΑ, πραγματοποιήσαμε πειράματα pull-down σε συνδιασμό με πειράματα φασματομετρία μάζας (MS) για να απομονώσουμε και να χαρακτηρίσουμε σύμπλοκα πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με την XPF κατά τη διάρκεια της μεταγεννητικής ανάπτυξης του ποντικού. Εντοπίσαμε 140 πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με την XPF οι οποίες ήταν κοινές μεταξύ τριών πανομοιότυπων πειραμάτων. Με την ανάλυση των δεδομένων από τα πειράματα φασματομετρία μάζας και την επαλήθευση των αλληλεπιδράσεων με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης, ήμασταν σε θέση να χαρακτηρίσουμε ένα νέο σύμπλοκο πρωτεϊνών που απαρτίζεται από τις ERCC1-XPF, CTCF, SMC1A, SMC3 και MBD2. Απαλοιφή της ERCC1 ή έκθεση σε παράγοντες που προκαλούν ICLs βλάβες στο DNA προκαλούν τον εντοπισμό του CTCF σε ετεροχρωματινικές περιοχές στον πυρήνα και την αποδέσμευση των CTCF, SMC1A, SMC3 και ATRX από υποκινητές και ρυθμιστικές περιοχές ICR των αποτυπωμένων γονιδίων. Σύμφωνα με τα ευρήματα αυτά, παρατηρούμε επίσης αλλαγή των μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων (PTMs) των ιστονών και την στρατολόγηση της RNAPII και βασικών μεταγραφικών παραγόντων σε υποκινητές και ρυθμιστικές περιοχές ICR των αποτυπωμένων γονιδίων. Ως αποτέλεσμα τα Ercc1-/- ποντίκια εμφανίζουν ανώμαλη έκφραση ενός υποσυνόλου αποτυπωμένων γονιδίων χωρίς να παρατηρείται διαταραχή στο πρότυπο μεθυλίωσης του DNA των ρυθμιστικών περιοχών ICRs των αποτυπωμένων γονιδίων. Αυτή η απόκριση είναι8κυτταρικά αυτόνομη και απαιτεί τη σηματοδότηση του παράγοντα ΑΤΜ. Προτείνουμε ότι η ERCC1-XPF δεσμεύει τους CTCF, SMC1A, SMC3 και MBD2 για να σχηματίσει ένα σύμπλοκο που απαιτείται για την αναπτυξιακή αποσιώπηση αποτυπωμένων γονιδίων και ότι συνεχείς βλάβες στο DNA πυροδότουν αλλαγές στη χρωματίνη επηρεάζοντας με τον τρόπο αυτό προγράμματα γονιδιακής έκφρασης που σχετίζονται με αναπτυξιακές διαταραχές του μονοπατιού NER.