Διερεύνηση της προστατευτικής δράσης των πυρηνικών υποδοχέων PPARα και PPARβ/δ σε συνθήκες καταπόνησης των καρδιομυοκυττάρων

Abstract

Heart failure still remains one of the leading causes of morbidity and mortality worldwide. A major contributing factor is reactive oxygen species (ROS) overproduction which leads to cardiac remodeling, partly through cardiomyocyte apoptosis. Peroxisome proliferator-activated receptors, are a group of nuclear receptors that function as transcriptional regulators of energy homeostasis. Given the role of metabolism imbalance under pathological states of the heart, PPARs have emerged as important therapeutic targets, and accumulating evidence highlights their protective role in the improvement of cardiac function under diverse pathological settings. Although the role of PPARs in the regulation of energy homeostasis is well documented, their effects related to the regulation of cellular inflammatory and redox responses in the heart are less studied. Τhe aim of this thesis was to investigate the potential protective effects evoked by activation of PPARs under pathological stimuli such as oxidative stress or inflammation. For this reason in the first experimental part the role of selective PPARβ/δ agonist GW0742, was investigated in the setting of oxidative stress induced by H2O2, in adult rat cardiomyocytes. Ιn the second part the role of PPARα agonist WY-14643 in hearts subjected to I/R was evaluated. The results showed that PPARβ/δ activation leads to the increase in cell viability of cardiomyocytes through attenuation of oxidative stress and inhibition of apoptosis. Moreover PPARβ/δ activation led to the inhibition of MMP2 and MMP-9 expressionas well as the total gellatinolytic activity. The in vivo WY-14643 administration led to the attenuation of post-ischemic contractile dysfunction. Moreover PPARα activation resulted in the upregulation of heme-oxygenase-1 and downregulation of MMP-2 expression and activity levels while it also led to the upregulation of the antiapoptoticBcl-2 comparing to pro-apoptotic Bax. These results suggest that PPARα and PPARβ/δ exert their cardioprotective actions against oxidative stress through regulation of ROS production, MMP expression and apoptosis. Given the role of PPARα in inflammation control, in the third part of the thesis the correlation between PPARα activation and the upregulation of the deubiquitinase CYLD, an important regulator of ΝF-κΒ pathway, was investigated. According to the results CYLD is upregulated upon in vitro or in vivo administration of PPAR ligands and simvastatin, an effect based on receptor activation, as proven by means of the PPARα antagonist, MK886. Moreover CYLD upregulation by WY-14643 and simvastatin during inflammation led to an increase in cell viability and the attenuation of TNF-α while IκΒα phosphorylation was decreased in cardiomyocytes stimulated byWY-14643 and simvastatin, implying the inhibition of ΝF-κΒ pathway. These results suggest a novel link between PPARα activation and CYLD upregulation and suggest a potentially important mechanism underlying the anti-inflammatory pleiotropic action of statins through NF-κB negative regulation by CYLD.

H καρδιακή ανεπάρκεια εξακολουθεί να αποτελεί μία από τις κυριότερες αιτίες νοσηρότητας και θνησιμότητας παγκοσμίως. Ένας σημαντικός παράγοντας που συμβάλλει στην εκδήλωση της, είναι η αυξημένη παραγωγή των ενεργών ριζών οξυγόνου (ROS), η οποία οδηγεί σε καρδιακή αναδιαμόρφωση εν μέρει μέσω της απόπτωσης των καρδιομυοκυττάρων. Οι υποδοχείς που ενεργοποιούνται από πολλαπλασιαστές υπεροξειδιοσωμάτων (PPARs) είναι μια ομάδα πυρηνικών υποδοχέων που λειτουργούν ως ρυθμιστές της ενεργειακής ομοιόστασης. Δεδομένης της έλλειψης ισορροπίας του μεταβολισμού σε παθολογικές καταστάσεις της καρδιάς, οι PPARs έχουν αναδειχθεί ως σημαντικοί θεραπευτικοί στόχοι και πολλαπλά δεδομένα υπογραμμίζουν το προστατευτικό ρόλο τους στη βελτίωση της καρδιακής λειτουργίας υπό ποικίλες παθολογικές συνθήκες. Αν και ο ρόλος των PPARs στον ενεργειακό μεταβολισμό της καρδιάς είναι καλά τεκμηριωμένος, οι δράσεις τους σε σχέση με η ρύθμιση της κυτταρικής φλεγμονώδους και οξειδοαναγωγικής απόκρισης είναι λιγότερο αποσαφηνισμένες. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση των πιθανών προστατευτικών δράσεων των PPARs σε συνθήκες καταπόνησης των καρδιομυοκυττάρων, όπως το οξειδωτικό στρες και η φλεγμονή. Για το λόγο αυτό, στο πρώτο πειραματικό μέρος διερευνήθηκε ο ρόλος του εκλεκτικού προσδέτη τουΡΡΑRβ/δ GW0742, στη ρύθμιση του οξειδωτικού στρες που επάγεται από το Η2Ο2, σε καρδιομυοκύτταρα ενήλικου επίμυος, ενώ στο δεύτερο τμήμα αξιολογήθηκε η επίδραση του προσδέτη του PPARα WY-14643, σε καρδιές επίμυων έπειτα από ισχαιμία-επανεμποτισμό (Ι/Ε). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ενεργοποίηση του υποδοχέα PPARβ/δ οδηγεί στην αύξηση της βιωσιμότητας των καρδιομυοκυτάρων μέσω αναστολής του οξειδωτικού στρες και της επαγόμενης απόπτωσης αλλά και μέσω ρύθμισης της έκφρασης και της συνολικής ζελατινολυτικής δραστηριότητας των μεταλλοπρωτεασών ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9. Αντίστοιχα, η χορήγηση του WY-14643 in vivo οδήγησε σε σημαντική βελτίωση της μεθισχαιμικής συσταλτικής δυσλειτουργίας. Η χορήγηση του WY-14643 οδήγησε σε επαγωγή της έκφρασης της οξυγενάσης της αίμης-1 και μείωσε τα επίπεδα mRNA και ενζυματικής δραστικότητας της ΜΜΡ-2, ενώ παράλληλα αύξησε την έκφραση της αντι-αποπτωτκής Bcl-2 σε σχέση με την προ-αποπτωτική Bax. Τα συγκεκριμένα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση τόσο του PPARα όσο και του ΡΡΑRβ/δ ασκεί προστατευτική δράση έναντι του οξειδωτικού στρες στη καρδιά, μέσω αναστολής της παραγωγής των ROS, ρύθμισης της έκφρασης των ΜΜPs και της απόπτωσης. Δεδομένου του αντι-φλεγμονώδους ρόλου του PPARα και των στατινών, στο τρίτο μέρος της διατριβής διερευνήθηκε η συσχέτιση της ενεργοποίησης του υποδοχέα με την επαγωγή της αποουβικουιτινάσης CYLD, ενός βασικού ρυθμιστήτου μονοπατιού του ΝF-κΒ. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα η CYLD επάγεται στην καρδιά από τους προσδέτες των PPARs και τη συμβαστατίνη έπειτα από in vitro καιin vivo χορήγηση τους, γεγονός που σχετίζεται με την ενεργοποίηση του υποδοχέα όπως προκύπτει από τη χρήση του ανταγωνιστή του PPARα ΜΚ886. Επιπλέον η επαγωγή της CYLD από τον προσδέτη του PPARα WY-14643 και τη συμβαστατίνη κατά τη φλεγμονή οδήγησε σε αύξηση της βιωσιμότητας των κυττάρων και εξασθένηση της έκφρασης του TNF-α, ενώ παράλληλα η φωσφορυλίωση του IKBα ήταν μειωμένη σε καρδιομυοκύτταρα που διεγέρθηκαν με WY-14643 καισιμβαστατίνη, υποδεικνύοντας μια αναστολή του μονοπατιού του ΝF-κΒ. Τα αποτελέσματα δείχνουν μια νέα σύνδεση μεταξύ της ενεργοποίησης του ΡΡΑRα και της αύξησης της έκφρασης της CYLD και προτείνουν έναν πιθανά σημαντικό μηχανισμό που υπογραμμίζει την αντιφλεγμονώδη πλειοτροπική δράση των στατινών, μέσω αρνητικής ρύθμισης του NF-κB από τη CYLD.