Ανίχνευση και τυποποίηση ιών γρίπης σε λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος

Abstract

Information on the drug susceptibility of influenza epidemic strains is important for antiviral resistance monitoring. In Greece, the 2009–2010 pandemic waves were very mild and seroprevalence rates remained low after this influenza season, resulting in exclusive detection of the pandemic strain during the 2010–2011 influenza season. In the present study during the post-pandemic 2010–2011 season,1215 samples from patients with influenza-like symptoms were analysed for detection of the influenza A(H1N1) 2009 virus and then 50 consecutive influenza A(H1N1) 2009 virus-positive samples from patients hospitalised in Greek hospitals were analysed for resistance to the neuraminidase inhibitor oseltamivir. All patients were hospitalised with severe influenza complications and had previously received oseltamivir. Influenza A(H1N1) 2009 virus detection and testing for oseltamivir resistance were performed with real-time PCR amplification assays. The H275Y substitution associated with resistance to oseltamivir was identified in two immunocompetent patients who received oseltamivir treatment for 3 days and 5 days, respectively. In both cases, patients were discharged in good condition despite development of resistance to antiviral treatment.

Οι ιοί της γρίπης είναι RNA ιοί που ανήκουν στην οικογένεια Orthomyxoviridae και αποτελούν μία από τις κυριότερες αιτίες λοιμώξεων, κυρίως του αναπνευστικού, παγκοσμίως, αφού προκαλούν εποχικές επιδημίες αλλά και θανατηφόρες πανδημίες.Οι ιοί της γρίπης διακρίνονται σε τρία γένη : Influenzavirus A, Influenzavirus B, Influenzavirus C. Οι ιοί της γρίπης διακρίνονται στα παραπάνω 3 γένη με βάση αντιγονικές διαφορές των νουκλεοπρωτεϊνών (ΝΡ) και των μεμβρανικών πρωρεϊνών (Μ) τους.Οι ιοί τύπου Α κατηγοριο-ποιούνται περαιτέρω με βάση τα επιφανειακά τους αντιγόνα, αιμοσυγκολλητίνη (ΗΑ) και νευραμινιδάση (ΝΑ). Έχουν αναγνωριστεί 16 ΗΑ και 9 ΝΑ αντιγόνα.Η επιδημιολογική επιτυχία των ιών της γρίπης οφείλεται σε δύο τύπους αντιγονικής μεταβολής της ΗΑ και ΝΑ, την αντιγονική εκτροπή ( με την οποία με μικρές αντικαταστάσεις αμινοξέων οι ιοί μπορούν να μεταβάλλονται από έτος σε έτος δίνοντας γένεση σε νέα στελέχη ικανά να προκαλέσουν νέες επιδημίες στα μεσοδιαστήματα των πανδημιών) και την αντιγονική μετατροπή (εμφάνιση ενός νέου υποτύπου των ιών της γρίπης τύπου Α με τελείως διαφορετική ΗΑ ή ΗΑ και ΝΑ, που δεν μπορούν να εξουδετερωθούν από τα αντισώματα που έχουν επαχθεί από τον προϋπάρχοντα υπότυπο, με αποτέλεσμα την αποτυχία προστασίας του πληθυσμού και την εμφάνιση πανδημίας).Ο ιός της γρίπης μεταδίδεται, κατά κύριο λόγο από άνθρωπο σε άνθρωπο, με τα σταγονίδια της αναπνευστικής οδού κατά τη διάρκεια της οξείας λοίμωξης (πρώτες 3-5 μέρες). Κύριοι υπεύθυνοι για τη μετάδοση είναι τα παιδιά προσχολικής ή σχολικής ηλικίας. Πιο ευάλωτα άτομα >65ετών και <5 και κυρίως <1 έτους. Στις χώρες με εύκρατο κλίμα, όπως η Ελλάδα, επιδημίες από Οκτώβριο έως Απρίλιο, με μεγαλύτερη έξαρση από Δεκέμβριο μέχρι Φεβρουάριο. Το φάσμα των συμπτωμάτων που εμφανίζονται κατά τη διάρκεια της λοίμωξης με τον ιό της γρίπης ποικίλλει.Η διάγνωση της γρίπης μπορεί να γίνει με βάση την κλινική εικόνα, αλλά η οριστική διάγνωση απαιτεί εργαστηριακή επιβεβαίωση. Η κλασσική μέθοδος ανίχνευσης των ιών της γρίπης είναι η απομόνωση του ιού σε κυτταροκαλλιέργεια. Αποτελεί μέθοδο αναφοράς, αφού μετά ο ιός μπορεί να υποστεί γενετική και αντιγονική ανάλυση, αλλά δεν είναι αρκετά γρήγορη ώστε να αποτελέσει τη βάση για την έναρξη θεραπείας ή τη λήψη μέτρων για τον έλεγχο μετάδοσης της λοίμωξης. Οι μοριακές μέθοδοι, όπως η PCR, χρησιμοποιούνται πλέον ευρέως, τόσο για τη διάγνωση της γρίπης, όσο και για την τυποποίηση του υπεύθυνου ιού. Χαρακτηρίζονται από μεγάλη ταχύτητα, ευαισθησία και ειδικότητα και τείνουν να γίνουν η μέθοδος αναφοράς για τη διάγνωση της γρίπης.Η θεραπεία της γρίπης περιλαμβάνει γενικά υποστηρικτικά μέτρα καθώς και ειδικά αντι-ιικά φάρμακα με κυριότερους εκπροσώπους τους αναστολείς της νευραμινιδάσης και δη την οσελταμιβίρη. Ενώ για την πρόληψη διατίθενται κάθε χρόνο ειδικά αντιγριπικά εμβόλια και σε ορισμένες περιπτώσεις συστήνεται χημειοπροφύλαξη μεαντι-ιικά.Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν: α) η εργαστηριακή διάγνωση και τυποποίηση των ιών της γρίπης, σε ασθενείς με λοίμωξη του αναπνευστικού, β) ο έλεγχος των ιών, που απομονώθηκαν από επιλεγμένα δείγματα, για την ύπαρξη ή όχι μεταλλαγής που προσδίδει αντοχή σε αντιιικό φάρμακο και για την ύπαρξη ή όχι μεταλλαγής που σχετίζεται με πρόσδεση του ιού της γρίπης σε διαφορετικό είδος υποδοχέων, γ) η επιδημιολογική παρατήρηση των στελεχών της γρίπης που κυκλοφορούν στην Ελλάδα, σε ειδικές ομάδες ασθενών (παιδιά, ασθενείς με χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια, ασθενείς με ανοσοκαταστολή). δ) συσχέτιση των δημογραφικών και κλινικών χαρακτηριστικών των ασθενών με τα αποτελέσματα της ιικής αναζήτησης , ώστε να διευκολύνεται ο κλινικός γιατρός στην εκτίμηση της κατάστασης του ασθενούς, πριν την παραλαβή των εργαστηριακών αποτελεσμάτων.Κατά τη διάρκεια μιας περιόδου γρίπης (από Οκτώβριο 2010 έως και Μάρτιο 2011) εξετάστηκαν 1215 δείγματα από ασθενείς με πιθανή λοίμωξη από τον ιό της γρίπης. Τα δείγματα ήταν ρινοφαρυγγικά και στοματο-φαρυγγικά επιχρίσματα και εκπλύματα, καθώς και υγρό από βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL), από ασθενείς των οποίων το ιστορικό και η κλινική εικόνα συνηγορούσαν υπέρ πιθανής λοίμωξης από τον ιό της γρίπης, από διάφορα νοσοκομεία των Αθηνών. Για κάθε δείγμα συλλέχθηκαν επιδημιολογικά στοιχεία, με έμφαση την ηλικία, το φύλο, την εθνικότητα του ασθενούς, το ιστορικό εμβολιασμού και λοιμώξεων, τα συμπτώματα της νόσου, τις επιπλοκές καθώς και υποκείμενες καταστάσεις που καθιστούν τον οργανισμό ευάλωτο στον ιό της γρίπης.Tα δείγματα, μετά την απομόνωση του γενετικού υλικού διερευνήθηκαν για την παρουσία ή όχι του πανδημικού Α(Η1Ν1)2009 με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (real-time PCR), με τη χρήση δημοσιευμένων εκκινητών (RealTime ready InfA(H1N1) detection set (Roche Applied Science, Basel, Switzerland). Στη συνέχεια ο έλεγχος της Η275Υ μεταλλαγής έγινε χρησιμοποιώντας ειδικό kit (Primer Design Ltd – Detection of Tamiflu resistant Swine H1N1 Influenza Human Pandemic Strain) , ενώ ο έλεγχος της D222G μεταλλαγής έγινε με την εμφωλεάζουσα (nested) PCR.Από τα συνολικά 1215 δείγματα που εξετάστηκαν στα 478 από αυτά ανιχνεύτηκε ο ιός Η1Ν1, ενώ τα υπόλοιπα ήταν αρνητικά (ποσοστό θετικών δειγμάτων = 39,3%). Σχεδόν στο σύνολο των θετικών δειγμάτων (98,7%) οι ασθενείς ανέφεραν αιφνίδια έναρξη συμπτωμάτων, με υψηλό πυρετό (>38,5°C). Βήχα ανέφερε το 89,2%, ενώ κεφαλαλγία, μυαλγίες και καταβολή το 82,3%. Σπανιότερα αναφέρθηκαν έμετοι και διάρροιες (36,7%).Από τα 478 θετικά δείγματα, η διάμεση ηλικία των ασθενών ήταν 40,46 έτη, κυμαινόμενη από 44 ημερών έως 88 ετών και ο λόγος άνδρες / γυναίκες ήταν 0,84 (218 (45,6%) άνδρες ασθενείς και 260 (54,4%) γυναίκες), 237 ασθενείς (49,6%) είχαν κάποιο υποκείμενο νόσημα και 110 (23%) παρουσίασαν κάποια επιπλοκή. Επίσης είναι εντυπωσιακό το γεγονός ότι μόνο 16 ασθενείς (3,3%) είχαν εμβολιαστεί για την εποχική γρίπη και μόλις 5 (1%) είχαν κάνει μία δόση του εμβολίου για την πανδημική γρίπη.Αξίζει να σημειωθεί ότι από τους 110 ασθενείς που παρουσίασαν επιπλοκές οι 77 (70%) ήταν άντρες και οι 39 (35,5%) είχαν κάποιο υποκείμενο νόσημα. Όσον αφορά τις επιπλοκές, οι συχνότερες αφορούσαν το αναπνευστικό σύστημα (97%). (107 από τους 110 ασθενείς παρουσίασαν πνευμονία ή/και αναπνευστική ανεπάρκεια, ένας εμφάνισε μυοκαρδίτιδα και δύο ,παιδιατρικοί ασθενείς, μυοσίτιδα (αύξηση της CPK). Από το σύνολο των ασθενών που βρέθηκαν θετικοί στον ιό Η1Ν1 έγινε επιλογή 50 ασθενών, οι οποίοι είχαν σοβαρή κλινική εικόνα, χρειάστηκε να νοσηλευτούν σε Μονάδες Εντατικής Θεραπείας (ΜΕΘ) και είχαν τεθεί σε θεραπεία με οσελταμιβίρη πριν την εισαγωγή τους στη ΜΕΘ. Τα στελέχη του ιού που απομονώθηκαν από αυτούς τους ασθενείς ελέγχθηκαν για την ύπαρξη ή όχι της μεταλλαγής Η275Υ.Οι ασθενείς αυτοί είχαν μέση ηλικία τα 45,38 έτη, κυμαινόμενοι από 16 έως 81 ετών, και ο λόγος ανδρών / γυναικών ήταν 1,78. Δεκατέσσερις ασθενείς ήταν ανοσοκατεσταλμένοι, έντεκα είχαν χρόνια καρδιαγγειακή ή/και αναπνευστική νόσο και εικοσιτέσσερις δεν είχαν κανένα υποκείμενο νόσημα. Όλοι οι ασθενείς ελάμβαναν αγωγή με οσελταμιβίρη (75mg × 2) για περίπου 5 ημέρες όταν έγινε η συλλογή του δείγματος. Η μεταλλαγή Η275Υ ανιχνεύτηκε σε δύο ασθενείς, οι οποίοι ανέπτυξαν αντοχή στην οσελταμιβίρη ενώ βρισκόντουσαν σε θεραπεία. Και οι δύο δεν είχαν εμβολιασθεί για τον ιό της γρίπης. Στη συνέχεια από το σύνολο των θετικών δειγμάτων για τον πανδημικό ιό Η1Ν1 έγινε επιλογή 200 δειγμάτων , από ασθενείς με νόσο βαρύτερης μορφής και επιπλοκή από το κατώτερο αναπνευστικό προκειμένου να ελεγχθεί η ύπαρξη ή όχι της μεταλλαγής D222G στο γονίδιο της αιμοσυγκολλητίνης. Σε κανένα από τα εξετασθέντα δείγματα δεν απομονώθηκε η μεταλλαγή D222G. Την περίοδο 2010-2011 αναφέρουμε τις πρώτες 2 περιπτώσεις στην Ελλάδα στελεχών του πανδημικού ιού Η1Ν1 που εμφάνισαν αντοχή στην οσελταμιβίρη. Όπως αναφέρεται και παγκοσμίως τα ανθεκτικά στελέχη συσχετίστηκαν με προηγηθείσα θεραπεία με οσελταμιβίρη. Ενώ στην Ελλάδα δεν υπήρξε συσχέτιση με τη δόση των αντι-ιικών ή με τη χρήση της οσελταμιβίρης ως χημειοπροφύλαξη. Συνοψίζοντας ο ιός της γρίπης προκαλεί σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα σε παγκόσμιο επίπεδο. Τα τελευταία 100 χρόνια υπήρξαν τέσσερις πανδημίες και η απειλή μιας νέας είναι πάντα παρούσα. Επομένως διαγνωστικές τεχνικές που επιτρέπουν το γρήγορο και ακριβή εντοπισμό των νέων στελεχών είναι ουσιώδους σημασίας. Επίσης η σταθερή ανίχνευση στελεχών του ιού ανθεκτικών στην οσελταμιβίρη καθιστά απολύτως αναγκαία αφενός την συνεχή επιτήρηση των ανθεκτικών στελεχών, με μελέτες σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων ή και με εφαρμογή νέας μεθόδου που να επιτρέπει την γρήγορη ανίχνευση των ανθεκτικών στελεχών, ώστε να εφαρμόζονται οι καταλληλότερες θεραπευτικές επιλογές κατά την περίοδο της εποχικής γρίπης ή τον πανδημιών και αφετέρου τη συνέχιση των ερευνών για αποτελεσματικά αντιιικά φάρμακα ώστε η παγκόσμια κοινότητα να είναι προετοιμασμένη σε περίπτωση κυριαρχίας των ανθεκτικών στην οσελταμιβίρη στελεχών της γρίπης.