Λειτουργική ανάλυση του γονιδίου Snipper στη Drosophila melanogaster

Abstract

ERI-1 (Enhanced RNAi) is an RNA exonuclease that was identified in a genetic screen in Ceanorabditis elegans as a negative regulator of RNA interference (RNAi). It has been proposed that ERI-1 exerts its action through the excision of the two protruding 3’ nucleotides that are present in siRNAs. This excision renders the siRNAs unfunctional. ERI-1 homologues in Homo sapiens and Mus musculus are interacting with 3’ end of histone mRNAs, participating in their maturation through the removal of two terminal nucleotides and their turnover at the end of S phase. Additionally ERI-1 in Schizosaccharomyces pombe, Ceanorabditis elegans and Mus musculus is involved in 5.8S rRNA maturation snipping 2 nucleotides from its 3’ end. It is apparent that ERI- 1 is an important exonuclease implicated in basic RNA mediated cellular mechanisms. For this reason we chose to investigate its function in Drosophila melanogaster where our knowledge has been limited to the biochemical characterization of the ERI-1 homologue Snipper (Snp) as an exonuclease. We used transposable element insertion lines in Snp, suppression of its expression through RNAi and overexpressing transgenic lines in order to assess its involvement in known pathways. Our results establish Snp as an important gene for normal Drosophila melanogaster development since it is a maternally provided transcript and reduction of its levels leads to developmental arrest in specific stages. Additionally, compromising Snp expression in various tissues causes abnormal phenotypes. In accordance to the atypical biogenesis of 5.8S rRNA in Drosophila melanogaster, it does not appear to be affected by the lack of Snp. On the contrary, in the case of the histonic transcripts we detected a significant reduction of their abundance upon Snp depletion. This reduction is most likely a direct effect, since Snp protein and histone mRNA physically interact as it was manifested by immunoprecipitation experiments. Additionally sequencing of histone 3 mRNA 3’ ends revealed that its processing is altered in the absence of Snp. Our hypothesis is that Snp participates in the maturation and protection of 3’ end of histonic mRNAs and its absence leads to reduced histone mRNA levels possibly through increased degradation. This in turn may lead to cell cycle delay or arrest causing the observed phenotypes.

Η RNA εξωνουκλεάση ERI-1 (Enhanced RNAi-1) εντοπίστηκε σε μια γενετική σάρωση στο Ceanorabditis elegans σαν αρνητικός ρυθμιστής της RNA παρεμβολής (RNAi). Ο μηχανισμός δράσης που προτάθηκε είναι η αποκοπή των δυο προεξεχόντων νουκλεοτιδίων από τα μικρά παρεμβαλλόμενα RNA (siRNA) γεγονός που τα καθιστά ανενεργά. Το ομόλογό της στον Homo sapiens και στον Mus musculus αλληλεπιδρά με το 3 ́άκρο των ιστονικών μεταγράφων απομακρύνοντας τα τελευταία νουκλεοτίδια τους και συμμετέχοντας στη ρύθμιση της αποικοδόμησης τους στο τέλος της S φάσης. Επιπλέον η ERI-1 στο Schizosaccharomyces pombe, το Ceanorabditis elegans και το Mus musculus συμμετέχει στην ωρίμανση του 5.8S rRNA αποκόπτοντας δυο νουκλεοτίδια από το 3 ́άκρο του. Φαίνεται λοιπόν ότι πρόκειται για μια σημαντική εξωνουκλεάση που παρεμβαίνει σε κεντρικούς κυτταρικούς μηχανισμούς που μεσολαβούνται από μόρια RNA. Για τον λόγο αυτό επιλέξαμε να μελετήσουμε τη δράση της στη Drosophila melanogaster όπου οι γνώσεις μας περιοριζόταν στον βιοχημικό χαρακτηρισμό του εκεί ομολόγου Snipper (Snp) σαν εξωνουκλεάση. Η μελέτη βασίστηκε σε μεταλλάγματα ένθεσης και υποέκφρασης του Snp μέσω RNA παρεμβολής, καθώς και σε διαγονιδιακές σειρές που το υπερεκφράζουν ώστε να διερευνηθεί η πιθανή εμπλοκή του σε κάποιο από τα γνωστά μονοπάτια. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το Snp είναι ένα απαραίτητο γονίδιο για την ανάπτυξη της Drosophila melanogaster. Τα μετάγραφα του παρέχονται στο έμβρυο από την μητέρα και η μείωση της έκφρασης του οδηγεί σε αναστολή της ανάπτυξης σε συγκεκριμένα στάδια. Επιπλέον η υποέκφραση του σε διάφορους ιστούς προκαλεί παραμορφώσεις και αποκλίσεις από τη φυσιολογική τους μορφολογία. Σε συμφωνία με την αποκλίνουσα βιογένεση του 5.8S rRNA στη δροσόφιλα η απουσία του Snp δε φαίνεται να το επηρεάζει. Αντίθετα στην περίπτωση των μεταγράφων των ιστονικών RNA η απουσία του Snp οδηγεί σε ανάλογη μείωση των επιπέδων τους. Το φαινόμενο αυτό οφείλεται σε άμεση επίδραση της πρωτεΐνης Snp επί των ιστονικών mRNA όπως δείξαμε με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης. Επιπλέον η αλληλούχιση των 3 ́άκρων των μεταγράφων της ιστόνης 3 έδειξε ότι η επεξεργασία τους απουσία της Snp είναι προβληματική, καθώς δεν αποκόπτονται τα δύο τελικά νουκλεοτίδια. Η υπόθεση πουΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ ΑΛΕΞΙΑΔΗΣ1προτείνεται είναι ότι η Snp συμμετέχει στην ωρίμανση ή/και στην προστασία του 3 ́άκρου των ιστονών. Η απουσία της οδηγεί σε μειωμένη αφθονία των ιστονικών μεταγράφων πιθανότατα λόγω αυξημένης αποικοδόμησης. Αυτό με τη σειρά του καθυστερεί ή αναστέλλει την ολοκλήρωση του κυτταρικού κύκλου.