In vivo βιολογική αξιολόγηση σαρτανών σε πειραματικά μοντέλα της υπέρτασης

Abstract

Hypertension is one of the most common diseases that occur in humans. A therapeutic approach for the treatment of hypertension is AT1 Angiotensin II receptor antagonists (Sartans). Angiotensin II is the main factor of the Renin - Angiotensin System and plays a determinant role in the regulation of blood pressure. The transdermal drug delivery method is very popular and is used in various treatments. An antihypertensive patch provides multiple benefits (controlled release of the active ingredient, reduced frequency of administration). Based on the above, the ultimate purpose of this present work was the in vivo biological evaluation of Sartans in an effort for transdermal delivery as an alternative therapy of hypertension.The first part of this effort involves the development and the optimization of analytical methodology using High Performance Liquid Chromatography (HPLC), for the detection and quantification of Sartans (Losartan, Valsartan) and of three new synthesized non-peptide antagonists of AT1 Angiotensin II receptor (BV6Na, V8COOH, V8K). These analytical methodologies were necessary for the in vitro experiments of percutaneous diffusion. Human skin used for the in vitro permeation studies were obtained from abdominal plastic surgery. In order to find an appropriate suspension formulation for each substance various suspensions were examined using a variety of permeation enhancers. Our aim was to quantify precisely the substances that passed through the skin by using HPLC. Comparing the rates of flux of the substances through the skin we concluded that the presence of two or more permeation enhancers leads to better permeation as they act synergistically and enhance the penetration of substances into the skin.The second part contains the in vivo experiments in Wistar rats. Initially, we developed a suitable non-invasive experimental model of hypertension with subcutaneous injections of Angiotensin II in order to evaluate the antihypertensive activity of substances. Specifically, Angiotensin II was subcutaneously injected in 8 Wistar rats at four different concentrations (25 μg / kg bw, 50 μg / kg bw, 75 μg / kg bw and 100 μg / kg bw) and pressor response of animals was recorded. The concentration of 50 μg / kg bw proved to be the correct dose that causes hypertensive response greater than 40% and maintained for at least 10 min. Furthermore, using this experimental model we evaluate the non-peptide antagonists of AT1 Angiotensin II receptor after the subcutaneous and transdermal administration, aiming alternative approaches for the treatment of hypertension. The in vivo results of transdermal administration of Losartan and Valsartan showed satisfactory drug release and prolong antihypertensive activity even after 24 h of administration. The synthesized Sartans (BV6Na, V8COOH, V8K) prevent the hypertensive response at 3, 6 and 8 hours after the subcutaneous administration. Finally, the transdermal administration showed weaker antihypertensive effect due to the low diffusion of these substances through the skin barrier.

Η υπέρταση θεωρείται μια από τις συχνότερες παθήσεις που εμφανίζονται στον ανθρώπινο πληθυσμό. Μια θεραπευτική προσέγγιση για την αντιμετώπισή της είναι οι ανταγωνιστές του ΑΤ1 υποδοχέα της Αγγειοτενσίνης ΙΙ (Σαρτάνες). Η Αγγειοτενσίνη ΙΙ αποτελεί το δραστικό οκταπεπτίδιο του συστήματος Ρενίνης – Αγγειοτενσίνης και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης. Ο διαδερμικός τρόπος χορήγησης των φαρμάκων είναι πολύ δημοφιλής και εφαρμόζεται σε διάφορες θεραπείες. Η δια επιθέματος αντιϋπερτασική αγωγή παρέχει πολλαπλά πλεονεκτήματα (ελεγχόμενη αποδέσμευση δραστικού συστατικού, μείωση συχνότητας χορήγησης). Βάσει των ανωτέρω, απώτερος στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η in vivo βιολογική αξιολόγηση σαρτανών σε μία προσπάθεια διαδερμικής χορήγησης σαν εναλλακτική θεραπεία της υπέρτασης.Το πρώτο μέρος της προσπάθειας αυτής περιλαμβάνει την ανάπτυξη και τη βελτιστοποίηση αναλυτικής μεθοδολογίας με χρήση Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (HPLC), για την ανίχνευση και ποσοτικοποίηση σαρτανών του εμπορίου (Λοσαρτάνη, Βαλσαρτάνη) και των συντιθέμενων μη πεπτιδικών ανταγωνιστών του ΑΤ1 υποδοχέα της Αγγειοτενσίνης ΙΙ (BV6Νa, V8COOH, V8K). Οι εν λόγω αναλυτικές μεθοδολογίες χρησιμοποιήθηκαν στα in vitro πειράματα διαδερμικής διάχυσης με χρήση ανθρώπινου δέρματος προερχόμενο από πλαστική επέμβαση κοιλίας. Δοκιμάστηκαν διάφορα διαλύματα με διαφορετικούς ενισχυτές διαπέρασης με σκοπό την εύρεση του κατάλληλου διαλύματος για κάθε υπό εξέταση ουσία. Στόχος ήταν ο ακριβής ποσοτικός προσδιορισμός των υπό εξέταση ουσιών που διαπέρασε το δέρμα με την χρήση Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης. Συγκρίνοντας τις τιμές της ροής των υπό εξέταση ουσιών καταλήγουμε ότι δύο ή περισσότεροι ενισχυτές δρουν συνεργειακά και ενισχύουν τη διείσδυση των ουσιών μέσα στο δέρμα.Το δεύτερο μέρος περιλαμβάνει τα in vivo πειράματα σε επίμυς της φυλής Wistar. Αρχικά αναπτύχθηκε κατάλληλο μη επεμβατικό πειραματικό μοντέλο υπέρτασης με in vivo υποδόρια χορήγηση Αγγειοτενσίνης ΙΙ προκειμένου αυτό να χρησιμοποιηθεί στη βιολογική αξιολόγηση των αντιϋπερτασικών σκευασμάτων. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε υποδόρια χορήγηση Αγγειοτενσίνης ΙΙ σε 8 Wistar rats σε τέσσερις διαφορετικές συγκεντρώσεις (25 μg/ kg b.w, 50 μg/ kg b.w, 75 μg/ kg b.w και 100 μg/ kg b.w.) και έγινε καταγραφή της υπερτασικής απόκρισης των πειραματοζώων. Η συγκέντρωση των 50 μg/ kg b.w αποδείχτηκε ότι είναι η κατάλληλη δόση που προκαλεί υπερτασική απόκριση μεγαλύτερη του 40% και διατηρείται για χρονικό διάστημα τουλάχιστον 10 λεπτών. Εν συνεχεία, μελετήθηκε η αντιϋπερτασική δραστικότητα μη πεπτιδικών ανταγωνιστών του ΑΤ1 υποδοχέα της Αγγειοτενσίνης ΙΙ μετά από υποδόρια και διαδερμική χορήγηση αποσκοπώντας σε εναλλακτικές προσεγγίσεις για την καταπολέμιση της υπέρτασης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τόσο η υποδόρια όσο και η διαδερμική χορήγηση της Λοσαρτάνης και της Βαλσαρτάνης προλαμβάνει την υπερτασική απόκριση τις πρώτες 24 ώρες. Οι συντιθέμενες σαρτάνες (BV6Na, V8COOH, V8K) προλαμβάνουν την υπερτασική απόκριση στις 3, 6 και 8 ώρες μετά την υποδόρια χορήγησή τους. Τέλος, η διαδερμική χορήγησή τους έδειξε ασθενέστερο αντιϋπερτασικό αποτέλεσμα που οφείλεται στη χαμηλή διάχυση των ουσιών αυτών διαμέσου του φραγμού του δέρματος.