Διαφορική ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 και του ιού HIV-1 από μεταγραφικούς καταστολείς σε παρθενικά και μνημονικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα

Abstract

IL-2 is the first cytokine produced when naive T helper (Th) cells are activated and differentiate into dividing pre-Th0 proliferating precursors. The HIV1 virus is transcriptionally active in activated CD4 T-cells, and inactive in naïve CD4 T-cells. IL-2 and HIV-1 expression is blocked in naive Th cells by a transcriptional silencer that binds to the ARRE-2/NFAT element of the IL-2 gene promoter and RATS-Repressor Activator Target Sequence of HIV1-LTR (-279 to -250bp). These two elements share a homologous sequence that encompasses the AAGGAG Εts-2 binding site. Herein we show that Ets-2 is the repressor of IL-2 and HIV-1-LTR expression in CD4+CD45RA+CD25-FoxP3- naive Th cells by binding to this common region. This silencing activity disappears in activated naïve Th cells and memory Th cells.We first measured the levels of ets-2 mRNA in activated with PMA/Ionomycin (P/I) or non activated (CM) peripheral blood-derived T-cells and 9 leukemic cell lines. Ets-2 mRNA was synthesized in T-cells and in the most cell lines when cultured in plain culture medium (CM), but its synthesis was severely reduced when the cells were stimulated. In naive Th cells, the ets-2 mRNA, quantity of Ets-2 protein and its binding activity to ARRE-2 and RATS sequence decrease upon Th cell activation, followed by a reciprocal expression of IL-2. Cyclosporine A stabilizes ets-2 mRNA and protein when the cells are activated.We transfected Jurkat cells with (i) the reporter plasmids IL-2-CAT, 4xARRE-CAT (4 copies of ARRE-2 sequence), 2xmutantARRE-CAT (carries a point mutation in the Ets-2 binding site) (ii) HIV1-LTR-CAT, 2xRATS-CAT (2 copies of RATS sequence), 2xmutantRATS-CAT (carries a point mutation in the Ets-2 binding site) and CMV-CAT (control), (iii) pCDNA3-ets2 (for ets-2 overexpression), (iv) ets-2 shRNA (to silence ets-2 expression in the cells). Co-transfection experiments in Jurkat cells with increasing amounts of pCDNA3-ets2, led to a gradual reduction of IL-2-CAT, 4xARRE-CAT, HIV1-LTR-CAT and 2xRATS-CAT transcriptional activity, upon cell stimulation with P/I, but not of CMV-CAT. No transcriptional response was observed for the 2xmutantARRE-CAT and 2xmutantRATS-CAT reporter genes. Cotransfection experiments with HIV1-LTR-CAT, 2xRATS-CAT and ets-2 shRNA led to an increase in both reporter genes activity but not for 2xmutantRATS-CAT and CMV-CAT. Also transfection of the Jurkat cell line with ets-2 shRNA clones led to a slight expression of endogenous IL- 2 mRNA confirming that Ets-2 acts as a repressor of IL-2 expression in these cells in non inductive conditions. Chromatin Imunoprecipitation experiments revealed that Ets-2 binding activity to the ARRE-2 element of the native IL-2 promoter is stronger in naive Th cells compared to activated or memory Th cells. In the same way when ChiP experiments performed in transfected with the HIV-1-LTR plasmid Jurkat cells, Ets-2 binding activity to the RATS element was stronger to the CM condition compared to the P/I where the Ets-2 binding activity disappears.In this work we suggest that ets-2 expression and protein binding to the ARRE-2 element of the IL-2 promoter are part of a strictly regulated process that results in a physiological transition of naive Th cells to Th0 cells upon antigenic stimulation. Malfunction of such a repression mechanism at the molecular level could lead to disturbed later events in Th cell plasticity, leading, in term, to autoimmune diseases or other pathological conditions. The transition of naive Th cells to memory and activated Th cells plays a crucial role in the activation of the HIV-1-LTR expression in the infected cells. Thus, our results also confirm the role of Ets-2 as a transcriptional repressor of HIV1. This HIV1-LTR-RATS-mediated repression may account for the low-level transcription and replication of HIV1 in naïve T-cells, and contribute to the viral latency and maintenance of viral reservoirs in patients, despite long-term therapy.

Η IL-2 είναι η πρώτη κυτταροκίνη η οποία εκκρίνεται όταν τα παρθενικά Τ βοηθητικά (Th) λεμφοκύτταρα ενεργοποιούνται και διαφοροποιούνται σε λειτουργικά Τh0 λεμφοκύτταρα, από τα οποία θα προέλθουν τα Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα των άλλων γραμμών διαφοροποίησης. Ο ιός HIV-1 είναι μεταγραφικά ενεργός στα ενεργοποιημένα CD4+ T κύτταρα και ανενεργός στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα. Η έκφραση της IL-2 και του HIV-1 εμποδίζεται στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα από την ύπαρξη ενός καταστολέα ο οποίος προσδένεται στην ARRE-2/NFAT περιοχή του υποκινητή της IL-2 και την RATS (Repressor Activator Target Sequence) αλληλουχία (-279 to -250bp) του HIV-1-LTR αντίστοιχα. Οι δύο αυτές περιοχές παρουσιάζουν νουκλεοτιδική ομολογία στην αλληλουχία τους και εμπεριέχουν το νουκλεοτιδικό μοτίβο AAGGAG, που αποτελεί αλληλουχία πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα Ets-2. Στην παρούσα διατριβή αποδείξαμε ότι ο παράγοντας Ets-2 είναι καταστολέας της έκφρασης της IL-2 και του HIV-1-LTR στα CD4+CD45RA+CD25-FoxP3- παρθενικά Τh κύτταρα, μέσω της πρόσδεσής του στην κοινή τους αλληλουχία. Η κατασταλτική αυτή δράση του παράγοντα Ets-2 παύει να υπάρχει στα μνημονικά Th κύτταρα ή όταν τα παρθενικά Th κύτταρα ενεργοποιηθούν.Αρχικά μετρήσαμε τα επίπεδα σύνθεσης του ets-2 mRNA σε υποπληθυσμούς T λεμφοκυττάρων και σε 9 λευχαιμικές κυτταρικές σειρές, πριν και μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων με τα μιτογόνα PMA/Ionomicyn (P/I). To ets-2 mRNA ανιχνεύθηκε στα Τ κύτταρα και στις περισσότερες κυτταρικές σειρές όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες καλλιεργητικό υλικό (CM), αλλά η σύνθεσή του μειώθηκε σημαντικά μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων (P/I). Στα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα τα επίπεδα του ets-2 mRNA και της Ets-2 πρωτεΐνης καθώς και η ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στις ARRE-2 και RATS αλληλουχίες, μειώνονται μετά την ενεργοποίηση των Th κυττάρων. Η μείωση αυτή ακολουθείται από ταυτόχρονη έκφραση της IL-2. Η προσθήκη κυκλοσπορίνης A στην καλλιέργεια των κυττάρων οδήγησε στην σταθεροποίηση της έκφρασης του ets-2 mRNA και πρωτεΐνης όταν τα κύτταρα έχουν πρώτα ενεργοποιηθεί.Στην συνέχεια διαμολύναμε τα κύτταρα Jurkat με (i) τα πλασμίδια IL-2-CAT, 4xARRE-CAT (φέρει 4 αντίγραφα της ARRE-2 αλληλουχίας), 2xmutantARRE-CAT (φέρει σημειακή μετάλλαξη στην αλληλουχία πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2) (ii) HIV1-LTR-CAT, 2xRATS-CAT (2 αντίγραφα της RATS αλληλουχίας), 2xmutantRATS-CAT (φέρει σημειακή μετάλλαξη στην αλληλουχία πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2) και CMV-CAT (control), (iii) pCDNA3-ets2 (για την υπερέκφραση της Εts-2 πρωτεΐνης), (iv) ets-2 shRNA (για την αποσιώπηση της έκφρασης του Ets-2 στα κύτταρα). Πειράματα συνδυαμολύνσεων στα Jurkat κύτταρα με αυξανόμενες ποσότητες του pCDNA3-ets2 οδήγησε σε σταδιακή μείωση της μεταγραφικής ενεργότητας των πλασμιδίων IL-2-CAT, 4xARRE-CAT, HIV1-LTR-CAT και 2xRATS-CAT μετά από μιτογονική διέγερση των κυττάρων με P/I. Καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στην μεταγραφική ενεργότητα των πλασμιδίων αναφοράς CMV-CAT, 2xmutantARRE-CAT και 2xmutantRATS-CAT. Αντίθετα, πειράματα συνδυαμολύνσεων με τα πλασμίδια αναφοράς HIV1-LTR-CAT, 2xRATS-CAT και τους κλώνους του ets-2 sh-RNA οδήγησε στην αύξηση της μεταγραφικής ενεργότητας και των δύο πλασμιδίων αναφοράς αλλά όχι για τα 2xmutantRATS-CAT και CMV-CAT. Επίσης η διαμόλυνση των Jurkat κυττάρων με τους κλώνους του ets-2 sh-RNA, απουσία σημάτων ενεργοποίησης, οδήγησε και στην έκφραση του ενδογενούς IL-2 mRNA. Η παρατήρηση αυτή επιβεβαιώνει την κατασταλτική δράση του παράγοντα Ets-2 στην έκφραση της IL-2 σε μη επαγώγιμες συνθήκες. Τα πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης αποκάλυψαν ότι η ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στο ARRE-2 στοιχείο του υποκινητή της IL-2, είναι ισχυρότερη στα παρθενικά Τh κύτταρα σε σχέση με τα ενεργοποιημένα ή μνημονικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα. Με την ίδια πειραματική διαδικασία αυτή την φορά σε Jurkat κύτταρα τα οποία είχαν διαμολυνθεί με το πλασμίδιο HIV-1-LTR παρατηρήθηκε ότι η ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα Ets-2 στην RATS αλληλουχία ήταν ισχυρότερη στην CM συνθήκη σε σχέση με το P/I όπου ο παράγοντας Ets-2 εξαφανίζεται από την RATS αλληλουχία.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή προτείνουμε ότι η έκφραση του ets-2 και η πρόσδεση της Ets-2 πρωτεΐνης στο ARRE-2 στοιχείο του υποκινητή της IL-2 αποτελεί μέρος μιας αυστηρά ρυθμιζόμενης διαδικασίας που έχει σαν τελικό αποτέλεσμα την μετάβαση των παρθενικών Τh λεμφοκυττάρων σε Th0 κύτταρα μετά από αντιγονική διέγερσή τους. Δυσλειτουργία ενός τέτοιου κατασταλτικού μηχανισμού σε μοριακό επίπεδο θα μπορούσε να οδηγήσει σε μετέπειτα διαταραχές στην πλαστικότητα των Th κυττάρων με αποτέλεσμα εμφάνιση αυτοάνοσων ή άλλων παθολογικών καταστάσεων. Η μετάβαση των παρθενικών Τh λεμφοκυττάρων στην μνημονική και ενεργοποιημένη κατάσταση των κυττάρων παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση της έκφρασης του HIV-1-LTR στα μολυσμένα κύτταρα. Αυτή η καταστολή του ιικού γονιδιώματος που διαμεσολαβείται μέσω της RATS αλληλουχίας μπορεί να ευθύνεται για την χαμηλή μεταγραφική ενεργότητα και πολλαπλασιασμού του ιού HIV-1 στα παρθενικά Τ βοηθητικά λεμφοκύτταρα και να συμβάλει στην λανθάνουσα κατάσταση του ιού στα κύτταρα αυτά καθώς και στην διατήρηση των ιικών αποθεμάτων παρά την μακράς διαρκείας θεραπεία.