Μελέτη βιοχημικών παραμέτρων βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος ασθενών με λιπώδη εμβολή

Abstract

The Fat Embolism Syndrome (FES) is a posttraumatic complication, which is usually encountered in patients with serious injuries, especially those with pelvic or long bone fractures. It can also occur as a complication during cardiopulmonary resuscitation or lipid infusion used for parenteral feeding.The aim of this study was to investigate the pathogenesis of acute lung injury during FES and to identify diagnostic markers through the evaluation of BAL (Bronchoalveolar Lavage) fluid alterations in trauma patients. In this direction, patients with FES who developed acute hypoxemic respiratory failure requiring mechanical ventilation were studied. BAL characteristics of the patients with FESwere compared to those from patients with acute lung injury — acute respiratory distress syndrome (ALI/ARDS) from other risk factors except FES and from mechanically ventilated patients without cardiopulmonary disease. The major laboratory findings on BAL fluid of patients with fat embolismwhere: 1) increased levels of total protein, phospholipids and neutral lipids, especially of total cholesterol, 2) elevated activities of PLA2, and 3) increased levels of PAF inversely correlated with PAF-AcH. The increased protein levels in BAL fluid of patients with FES were a consistent finding, signifying an increase in alveolar-capillary permeability. This indicates that FES is associated with an alveolar-capillary barrier disorder leading to an acute lung injury with high permeability pulmonary edema. Of note, the increased concentration of protein in the alveolar space could further disturb the biophysical properties of surfactant resulting in hypoxemia. An interesting finding in this study was the prominently high concentration of neutral lipids and especially that of total cholesterol and cholesterol esters in BAL from all FES patients compared to both control and ARDS patients. The origination of neutral lipids is clearly from bone marrow, where they exist in high concentrations. The levels of total cholesterol and cholesterol esters can distinguish FES from ARDS due to other causes. Therefore, the measurement of BAL total cholesterol levels could be a diagnostic tool of FES, at least of those with a manifestation of acute lung injury. Total phospholipid content in the FES was significantly higher compared to both controls and ARDS patients. Total phospholipids were also elevated in ARDS patients in comparison to normal group. In a previous work we have observed an increase of total phospholipids during early ARDS. In both groups, FES and ARDS,the BAL was performed during the first three days, period which is considered as early phase of the disease. This increase of phospholipids in FES could derive first from the bone marrow fat passing into the alveolar space through the increased alveolar-capillary membrane permeability and secondly from a local production, or probably to both. Whether the local increase of phospholipids was caused by an enhanced production, secretion or by a defect in reuptake of phospholipids by type II alveolar cells remains to be elucidated. It is known that hyperventilation promotesphospholipid production by acetylcholine or beta-adrenergic agonists-mediated mechanisms. Finally, PAP, according to some investigators could increase surfactant production and/or secretion. It is of note that PAF was found in very high levels in BAL fluid from FES compared to both control and ARDS patients. The qualitative alterations of surfactant were similar with those of ARDS patients. The decrease of PC could be attributed to a dysfunction of type Π alveolar cells, which are the main cellular source for these phospholipids. These alterations could directly affect surfactant biophysical activity. Elevated PAF levels could be related to a local inflammatory reaction. PAF could be implicated in pulmonary edema formation because of its ability to cause micro vascular leaking, to stimulate biosynthesis of potent inflammatory mediators, as well as to induce pulmonary venous vasoconstriction increasing the pulmonary capillary pressure. PAF binding to cell surface receptor could regulate recruitment, activation and adhesion of neutrophils. It is synthesized by a variety of cells including alveolar macrophages, neutrophils and alveolar epithelial cells and acts locally, because it is rapidly inactivated by the circulating PAF-AcH. PAF-AcH plays a major role in the potential for PAF to function as an autacoid. The feet that PAF-AcH has inverse correlation with PAF may suggest that PAF-AcH is also locally produced. The feet that no correlation was found between PAF and PAF-AcH in ARDS patients from other reasons is not well understood. One explanation could be that in ARDS patients the majority of PAF-AcH was originating from plasma, where it exits in high concentrations. The production of PAF is also regulated by phospholipase A2, which was increased in FES as well as in ARDS patients compared to controls. Phospholipase A2 can affect pulmonary function either directly, by hydrolyzing lung surfactant phospholipids and increasing surface tension or indirectly, through the production of biologically active molecules such asplatelet-activating factor (PAF), lyso-phosphatidylcholine and eicosanoids. PLA2 could be produced locally by inflammatory cells and secreted into the alveolar space. Alveolar macrophages are also considered as major source of PLA2 in the lung. In addition, various cell types, such as platelets, mast cells, fibroblasts, macrophages and neutrophils produce and secrete PLA2 following stimulation. The involvement of phospholipase A2 in ARDS has been shown in a study with animal models where the enzyme was increased in correlation with the severity of lung injury. The high levels of lyso-phosphatidylcholine in our patients with FES strongly indicate that PLA2 is implicated in the pathogenesis of the syndrome, given that PLA2 catalyses the degradation of PC to lyso-PC and free fatty acids. Against our expectations though, the percentage of free fatty acids in our patients with FES was lower compared to ARDS group, although it was higher than in our normalgroup. One explanation for this could be the transacylation of free fatty acids to cholesterol esters (possibly via acyl-CoA-cholesterol acyltransferase), which were found to be significantly increased. The free fatty acids used as substrates in this procedure could possibly derive: 1) from triglycerides which are converted to monoglycerides through a triglyceride lipase activatioa This interpretation is in consistence to the increased monoglycerides and the decreased triglycerides in BAL from our patients with FES compaired to both controls land 2 2) from phospholipids and especially from PC due to the increased phospholipase A2 activity. Of note, PC was decreased in FES patients in comparison with our normal group. In conclusion, the high levels of protein concentration in BAL fluid from FES patients strongly suggests an increased capillary-alveolar membrane permeability.This confirms that FES is a risk factor for acute lung injury. The increased capillaryalveolar membrane permeability could also be an explanation for the observed increase of total phospholipids. This increase of total phospholipids could also signify an increase of surfactant production and/or secretion by type II alveolar cells. The stimulation of type II cells could be mechanical or chemical. The increased levels of PLA2 activity, leading to changes in the lipid profile of BAL fluid, indicate activation of enzymic or oxidation processes. Therefore, PLA2 as well as PAF-AcH could play an important role in the development or down-regulation of inflammation Iin FES, respectively. Finally, the increase of neutral lipids and especially cholesterol and esters in BAL fluid could be a significant diagnostic tool and might clearly distinguish patients with FES from controls and those with ARDS.

Το Σύνδρομο της Λιπώδους Εμβολής είναι μια μετατραυματική επιπλοκή, η οποία εμφανίζεται σε ασθενείς με σοβαρά κατάγματα, συνήθως της πυέλου ή των μακρών οστών. Επίσης, μπορεί να επιπλέξει την καρδιοαναπνευστική ανάνηψη ή τη θεραπεία με παρεντερική διατροφή. Σύμφωνα με την επικρατούσα εκδοχή τα ουδέτερα λιπίδια αρχικά εισέρχονται στον πνεύμονα και προκαλούν απόφραξη των τριχοειδών αγγείων, ενώ στη συνέχεια οι λιπάσες που υπάρχουν τοπικά υδρολύουναυτά τα λιπίδια απελευθερώνοντας ελεύθερα λιπαρά οξέα, τα οποία όμως είναι ιδιαίτερα τοξικά για τον πνεύμονα. Το σύνδρομο χαρακτηρίζεται από μια κλασσική τριάδα συμπτωμάτων και σημείων, τα οποία εμφανίζονται 24-72 ώρες μετά το τραύμα: οξεία αναπνευστική ανεπάρκεια, νευρολογικές διαταραχές και έκθυση πετεχειώδους εξάνθηματος. Συχνά, εντούτοις, ένα ή περισσότερα από αυτά τα ευρήματα απουσιάζουν. Σε ασθενείς μάλιστα με μεμονωμένα αναπνευστικά συμπτώματα, η εμφάνιση υποξαιμίας και πνευμονικών διηθημάτων συχνά συγχέεται με άλλα πιο συχνά προβλήματα, όπως η πνευμονία από εισρόφηση και η πνευμονική θλάση. Επιπλέον, οι νευρολογικές διαταραχές δεν είναι παθογνωμονικές και μπορεί να αποδοθούν από λάθος σε μετατραυματική εγκεφαλική βλάβη ή σε άλλα αίτια. Η διάγνωση επομένως του συνδρόμου δεν είναι εύκολη και συχνά καθυστερεί με αποτέλεσμα να χάνεται πολύτιμος χρόνος για την αντιμετώπιση του ασθενή. Μέχρι σήμερα έχουν προταθεί διάφορες εργαστηριακές δοκιμασίες για τη διάγνωση του Συνδρόμου της Λιπώδους Εμβολής, όπως η ανίχνευση λιποσφαιρίων στα ούρα και στο αίμα, η μέτρηση της ενεργότητας της λιπάσης του ορρού και η ανίχνευση στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα κυττάρων που περιέχουν έγκλειστα λίπους. Οι μέθοδοι αυτοί, όμως, υστερούν σε ευαισθησία και ειδικότητα, και για το λόγο αυτό η εύρεση ειδικών δεικτών στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, που θα μπορούσαν να βοηθήσουν στη διάγνωση αυτού του συνδρόμου είναι πολύ σημαντική. Σκοπός της εργασίας μας ήταν η διερεύνηση της παθογένεσης της οξείας πνευμονικής βλάβης κατά τη διάρκεια του Συνδρόμου της Λιπώδους Εμβολής και η εύρεση ειδικών δεικτών στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, που θα μπορούσαν να βοηθήσουν στη διάγνωση αυτού του συνδρόμου. Για το λόγο αυτό σε ασθενείς με το Σύνδρομο της Λιπώδους Εμβολής, οι οποίοι ανέπτυξαν οξεία αναπνευστικήανεπάρκεια με συνοδό υποξαιμία και χρειάστηκαν μηχανική υποστήριξη της αναπνοής προσδιορίστηκαν για πρώτη φορά η ολική πρωτεΐνη, τα ολικά φωσφολιπίδια, οι ολικοί εστέρες και η ολική χοληστερόλη στο BAL. Επιπρόσθετα, προσδιορίστηκαν στο BAL αυτών των ασθενών οι ενεργότητες της PAF-AcH και της PLA2, καθώς και τα επίπεδα του PAF. Κατόπιν, έγινε προσδιορισμός του είδους και του ποσοστού των ουδετέρων λιπιδίων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα. Στη συνέχεια έγινε σύγκριση των βιοχημικών χαρακτηριστικών του βρογχοκυψελιδικούεκπλύματος των ασθενών με το Σύνδρομο της Λιπώδους Εμβολής με εκείνα των ασθενών με οξεία πνευμονική βλάβη-Σύνδρομο Οξείας Αναπνευστικής Δυσχέρειας των Ενηλίκων από άλλους λόγους (ομάδα ελέγχου 1) και από μηχανικά αεριζόμενους ασθενείς, οι οποίοι δεν εμφάνιζαν καρδιοπνευμονική νόσο (ομάδα ελέγχου 2). Τα κύρια εργαστηριακά ευρήματα στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των ασθενών με λιπώδη εμβολή ήταν: 1) αυξημένα επίπεδα ολικής πρωτεΐνης, φωσφολιπιδίων και ουδετέρων λιπιδίων, ιδιαίτερα της ολικής χοληστερόλης σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου 1 και 2. 2) σημαντική μείωση του κλάσματος των τριγλυκεριδίων και των ελεύθερων λιπαρών οξέων και μία σημαντική αύξηση του κλάσματος των εστέρων της χοληστερόλης στους ασθενείς με FES σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου 1 και 2. 3) οι μεταβολές στα ποσοστά των επιμέρους τάξεων των φωσφολιπιδίων στους ασθενείς με FES ήταν παρόμοιες με αυτές που παρατηρήθηκαν στους ασθενείς με ARDS (ομάδα ελέγχου 1). 4) αυξημένη ενεργότητα της φωσφολιπάσης Ας σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου 1 και 2. 5) αυξημένα επίπεδα PAF σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου 1 και 2. 6) τα αυξημένα επίπεδα PAF είχαν αντίστροφη γραμμική συσχέτιση με την PAFAcH μόνο στους ασθενείς με FES. 7) αυξημένη συγκέντρωση των ολικών εστέρων του BAL στους ασθενείς με FES σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου 1 και 2. 8) μια σημαντική αύξηση στη σύσταση του κλάσματος της PC σε ελαΐκό και στεατικό οξύ στους ασθενείς με FES σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου 2. Αντίθετα, παρατηρήθηκε μια μικρή μείωση σε παλμιτικό οξύ σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου 1 και 2. 9) Η ανάλυση της σύστασης των κλασμάτων των μονογλυκεριδίων, των διγλυκεριδίων, των τριγλυκεριδίων, των ελεύθερων λιπαρών οξέων και της » __χοληστερόλης έδειξε διαφοροποιήσεις τόσο στην ομάδα των ασθενών με FESόσο και στην ομάδα των ασθενών με ARDS σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου 2. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε μείωση του παλμιτικού οξέως που υποδηλώνει μείωση της DPPC, ενώ οι διαφοροποιήσεις στη σύσταση των κλασμάτων των ουδετέρων λιπιδίων μπορεί να οφείλονται στην κατάτμηση των λιπαρών αλυσίδων στις θέσεις των διπλών δεσμών με σκοπό τη δημιουργία μορίωνμιμητών του PAF. 10) αυξημένος αριθμός κυψελιδικών μακροφάγων που βάφτηκαν με τη χρώση Sudan Black Β στους ασθενείς με FES σε σύγκριση με τους ασθενείς των ομάδων ελέγχου 1 και 2 Οι αυξημένες συγκεντρώσεις πρωτεΐνης που βρέθηκαν στο BAL των ασθενών με το Σύνδρομο της Λιπώδους Εμβολής και σε ασθενείς με ARDS σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου 2 δείχνουν την ύπαρξη αυξημένης τριχοειδοκυψελιδικής διαπερατότητας. Το γεγονός αυτό αποτελεί ένδειξη ότι το Σύνδρομο της Λιπώδους Εμβολής βλάπτει τον τριχοειδοκυψελιδικό φραγμό, με αποτέλεσμα την εμφάνιση οξείας πνευμονικής βλάβης με συνοδό πνευμονικό οίδημα. Η σημαντικά αυξημένησυγκέντρωση πρωτεΐνης στους ασθενείς με FES σε σύγκριση με του ασθενείς που εμφάνισαν πνευμονική βλάβη από ARDS, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τη διάγνωση του FES. Η αυξημένη αυτή τριχοειδοκυψελιδική διαπερατότητα της μεμβράνης μπορεί να αποτελεί μία πιθανή εξήγηση και για την αύξηση που παρατηρείται στα ολικά φωσφολιπίδια. Μια δεύτερη πιθανή εξήγηση για αυτή την αύξηση των ολικών φωσφολιπιδίων αποτελεί η αύξηση της παραγωγής του επιφανειοδραστικού παράγοντα και/ ή της έκκρισής του από τα κυψελιδικά κύτταρα τύπου Π εξαιτίας της διέγερσης αυτών των κυττάρων από μηχανικά ή χημικά ερεθίσματα. Η αυξημένη ενεργότητα PLA2 που βρέθηκε στους ασθενείς με λιπώδη εμβολή σε σύγκριση και με τις δυο ομάδες ελέγχου πιθανά οφείλεται σε αυξημένη τοπική παραγωγή και έκκριση στον κυψελιδικό χώρο από τα φλεγμονώδη κύτταρα. Πραγματικά, μεγάλη ποικιλία κυττάρων όπως αιμοπετάλια, μαστοκύτταρα,ινοβλάστες, μακροφάγα και ουδετερόφιλα παράγουν και εκκρίνουν PLA2 μετά από διέγερσή τους. Τα υψηλά αυτά επίπεδα φωσφολιπάσης επηρεάζουν άμεσα την πνευμονική λειτουργία προκαλώντας αλλαγές στο λιπιδικό προφίλ του BAL δια μέσω ενεργοποίησης ενζυμικών ή οξειδωτικών διαδικασιών (πχ. υδρόλυση των φωσφολιπιδίων του επκρανειοδρασπκού 7ΐαράγοντα). Η πνευμονική λειτουργίαεπηρεάζεται και έμμεσα από την PLA2 δια μέσω της παραγωγής βιολογικά δραστικών μορίων, όπως είναι ο PAF, η λυσο-PC και τα εικοσανοειδή. Με τον τρόπο αυτό η PLA2 προάγει την φλεγμονή στο Σύνδρομο της Λιπώδους Εμβολής με αποτέλεσμα η εύρεση αυξημένων επιπέδων της να μπορεί πιθανά να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης διάγνωσης ή ακόμη και πρόγνωσης, αν και απαιτούνται περισσότερες μελέτες. Στο παρελθόν, μόνο η PLA2 του ορρού έχει χρησιμοποιηθεί ως δείκτηςδιάγνωσης Η PAF-AcH, η οποία βοηθά στη μείωση της φλεγμονής, βρέθηκε να έχει αντίστροφη γραμμική συσχέτιση με τον PAF μόνο στην ομάδα των ασθενών με FES, τα επίπεδα του οποίου στους ασθενείς με λιπώδη εμβολή ήταν ιδιαίτερα αυξημένα σε σύγκριση και με τις δυο ομάδες ελέγχου. Το γεγονός αυτό μας οδηγεί στη σκέψη ότι η PAF-AcH παράγεται τοπική προ κειμένου να ανταγωνιστεί τις προφλεγμονώδεις δράσεις του PAF. Τα παραπάνω ευρήματα περιγράφονται γιαπρώτη φορά στη βιβλιογραφία. Τα επίπεδα των ουδετέρων λιπιδίων και ιδιαίτερα της χοληστερόλης στους ασθενείς με λιπώδη εμβολή βρέθηκαν ιδιαίτερα αυξημένα σε σύγκριση με τους ασθενείς των ομάδων ελέγχου 1 και 2. Είναι φανερό ότι οι αυξημένες αυτές συγκεντρώσεις ουδετέρων λιπιδίων προέρχονται από τον μυελό των οστών, ο οποίος αποτελεί την πηγή των λιπιδικών εμβόλων. Η αύξηση της συγκέντρωσης των εσπέρων της χοληστερόλης στους ασθενείς με Λιπώδη Εμβολή πιθανά οφείλεται στην τρανσακυλίωση των ελεύθερων λιπαρών οξέων προς εστέρες χοληστερόληςπιθανά δια μέσω του ενζύμου ακυλ-ΟοΑ-χολεστέρυλ-ακυλτρανσφεράσης. Τα ελεύθερα λιπαρά οξέα προέρχονται είτε από τη διάσπαση των τριγλυκεριδίων σε μονογλυκερίδια και ελεύθερα λιπαρά οξέα με τη δράση της λιπάσης των τριγλυκεριδίων, είτε από φωσφολιπίδια και ιδιαίτερα από τη φωσφατιδυλοχολίνη με υδρόλυσή τους από την PLA2. Η αύξηση των ουδετέρων λιπιδίων και ιδιαίτερα της χοληστερόλης και των εστέρων της χοληστερόλης που παρατηρήθηκαν στο BALασθενών με Λιπώδη Εμβολή σε σύγκριση με τις δυο ομάδες ελέγχου αποτελούν πολύ σημαντικά ευρήματα, τα οποία θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες διάγνωσης, δεδομένου ότι μπορούν να μετρηθούν εύκολα και να διαχωρίσουν τους ασθενείς με FES από τους ασθενείς με ARDS και τους ασθενείς χωρίς πνευμονική βλάβη. Προκειμένου να επιβεβαιώσουμε τα παραπάνω συμπεράσματα, προχωρήσαμε στη διεξαγωγή κατάλληλου μοντέλου πειραματικής λιπώδους εμβολής σε πειραματόζωα. Στο παρελθόν, 'έχουν αναφερθεί μελέτες λιπώδους εμβολής σε πειραματόζωα, που όμως αφορούσαν μόνο την ενεργότητα της PLA2 ή ιστολογικές αναλύσεις. Σύμφωνα με το πρωτόκολο, έγινε λήψη κατάλληλης ποσότητας BAL, καθώς και αρτηριακού και φλεβικού αίματος αμέσως πρίν, κατά τη διάρκεια και μετά το τέλος της διαδικασίας της τεχνητής λιπώδους εμβολής. Οι μετρήσεις που έγιναν αφορούν την ολική πρωτεΐνη, τα ολικά φωσφολιπίδια, τους ολικούς εστέρεςκαι την ολική χοληστερόλη. Επιπρόσθετα, προσδιορίστηκαν οι ενεργότητες της PAF-AcH και της PLA2. Τα αποτελέσματα αυτών των μετρήσεων επιβεβαιώνουν τις υποθέσεις που κάναμε για την παθογένεση των βιοχημικών μεταβολών στο BAL που συνοδεύουν το Σύνδρομο της Λιπώδους Εμβολής.