Μελέτη των παραγόντων που επηρεάζουν την ενεργότητα της PAF-ακετυλοϋδρόλυσης στην λιποπρωτεΐνη (a): ρόλος στην αθηροθρόμβωση

Abstract

Lipoprotein(a) [Lp(a)] is enriched in platelet activating factor acetylhydrolase (PAFAH) acfivity. Thus, a functional characteristic of Lp(a), is its capability to hydrolyze and inactivate PAF and oxidized phospholipids, molecules that exert potent proinflammatory and pro-atherogenic activity. We studied the specific activity and the apparent kinetic constant Km, Vmax of the Lp(a)-associated PAF-AH in patients with CAD, in comparison to that of the LDL-associated PAF-AH activity. Twenty patients with CAD and 25 control subjects participated in the study. Lp(a) was measured byELISA, and apo(a) isoform size was studied by 1.5% SDS-agarose gel electrophoresis and expressed as number of Kringle 4 (K4) repeats. Lp(a) was isolated from plasma by affinity chromatography onto a Lysine-Sepharose 4B column, while LDL by ultracentrifugation. The PAF-AH activity on Lp(a) as well as the enzyme activity on LDL were determined by the trichloroacetic acid precipitation method. The specific activity as well as the apparent kinetic constants of Lp(a)associated PAF-AH were significantly lower in CAD patients, a phenomenon that not observed on LDL. All CAD patients participated in the study were receiving statin . therapy before the blood sampling. To investigate whether statin therapy might have any impact on the Lp(a)-associated PAF-AH activity, we enrolled in the study 11 patients with primary hypercholesterolemia (dyslipidemia of type IIA), and we determined the Lp(a) and LDL-associated enzyme activity before and 5 months after the initiation of therapy. Atorvastatin therapy in hypercholesterolemic patients did not affect either the activity or the kinetic constants of PAF-AH associated with Lp(a) whereas it significantly reduced the LDL-associated PAF-AH activity and kinetic constants. However, removal of apo(a) from Lp(a) of CAD patients by reductive cleavage resulted in a significant increase in the specific activity and kinetic constants of PAF-AH on reduced Lp(a), a phenomenon which was not observed on Lp(a) of the 3t control population. The above results suggest that the apo(a) moiety of Lp(a) may . play an important role in the lower activity and kinetic constants of the PAF-AHassociated with this lipoprotein in CAD patients, diminishing the capability of Lp(a) to degrade and inactivate proinflammatory and proatherogenic phospholipids. Except from being a substrate for PAF-AH, PAF is also a potent agonist for platelets. We studied the effect of Lp(a) on PAF-induced platelet activation. In PRP, Lp(a) inhibited in a dose dependent manner the primary aggregation induced by PAF as well as the secondary one which is due to other agonists that are secreted fromactivated platelets. The observed inhibition was found to be decreased in the presence on CP/CPK and aspirin. In addition, Lp(a) fully inhibited the ATP secretion (a marker of dense granules) from platelets activated with PAF. This phenomenon wasn’t specific to PAF, since similar inhibition was observed when ADP and TRAP were used as agonists. Subsequently, we performed flow cytometry study in an effort to further investigate the mechanisms of Lp(a)-inducing inhibition of plateletaggregation. The effect of Lp(a) on the expression on integrin receptor 04^3 was determined on platelets activated by PAF. We observed that Lp(a) effectively inhibited the expression of αιη>β3 in the presence or, the absence of CP/CPK and aspirin. In order to investigate the structural characteristics of Lp(a) that are responsible for its biological activity, washed platelets were prepared. We found that both Lp(a) and Lp(a-) significantly inhibited the aggregation and the expression of .. otiibP3 on PAF-activated platelets, while LDL had no effect. Inactivation of endogenous PAF-AH had no effect on the inhibitory activity of Lp(a). When TRAP was used as agonist, Lp(a) and LDL exhibited similar inhibition of platelet activation. Furthermore we also found that the binding of Fg-FITC was significantly inhibited by Lp(a) on ADP-activated platelets. In conclusion, Lp(a) may inhibit platelet activation by non specific mechanism influencing the expression of otnbp3 and fibrinogen binding. Neither apo(a) nor Lp(a)’s PAF-AH content seems to play an important role in that phenomenon. The above findings suggest a novel mechanism by which Lp(a) may participate in the pathophysiology of thrombosis.

Το σωματίδιο της λιποπρωτεΐνης (a) [Lp(a)] είναι εμπλουτισμένο σε ενεργότητα ακετυλοϋδρολάσης του παράγοντα ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων (PAF-AH). Έτσι ένα λειτουργικό χαρακτηριστικό της Lp(a) είναι η υδρόλυση και απενεργοποίηση του PAF αλλά και των οξειδωμένων φωσφολιπιδίων, μόρια τα οποία ασκούν προφλεγμονώδη και προαθηρογόνο δράση. Στην διατριβή αυτή μελετήθηκανη ενεργότητα αλλά και οι φαινόμενες κινητικές σταθερές Km και Vmax της PAF-AH στην Lp(a) σε σύγκριση με αυτές του ενζύμου που βρίσκεται συνδεδεμένο στην LDL σε στεφανιαίους ασθενείς και υγιείς μάρτυρες. Στην μελέτη πήραν μέρος 20 στεφανιαίοι ασθενείς καθώς και 25 υγιείς μάρτυρες. Τα επίπεδα της Lp(a) μετρήθηκαν με μέθοδο ELISA, ενώ οι ισομορφές της apo(a) προσδιορίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα 1.5% SDS-αγαρόζης και εκφράστηκαν ως αριθμός επαναλαμβανόμενων Kringle 4 (Κ4). Η απομόνωση της Lp(a) από το πλάσμα έγινε με χρωματογραφία συγγένειας σε στήλη Lysine-Sepharose 4Β, ενώ αυτή της LDL με υπερφυγοκέντρηση. Η ενεργότητα της PAF-AH προσδιορίστηκε με την μέθοδο καταβύθισης με τριχλωροξικό οξύ. Η ειδική ενεργότητα και οι φαινόμενες κινητικές σταθερές της PAF-AH στην Lp(a) ήταν σημαντικά μικρότερες στους στεφανιαίους ασθενείς σε σύγκριση με τους μάρτυρες, ένα φαινόμενο το οποίο δεν παρατηρήθηκε στους μάρτυρες. Λαμβάνοντας υπόψη ότι όλοι οι στεφανιαίοι ασθενείς της μελέτης ελάμβαναν υπολιπιδαιμική αγωγή θελήσαμε να διερευνήσουμε τη πιθανή επίδραση αυτής στην ενεργότητα της PAF-AH της Lp(a) στα άτομα αυτά. Για το σκοπό αυτό έγινε στην μελέτη πήραν μέρος και 11 ασθενείς με πρωτοπαθή υπεχοληστερολαιμία (δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΑ) στους οποίους έγινε προσδιορισμός της ενεργότητας του ενζύμου στις Lp(a), LDL πριν και μετά την 5μηνη χορήγηση ατορβαστατίνης. Η θεραπεία με ατορβαστατίνη σύμφωνα με τα αποτελεσματά μας προκάλεσε σημαντική μείωση της ενεργότητας της PAF-AH στην LDL, ενώ αντίθετα δεν επηρέασε την ενεργότητα της PAF-AH στην Lp(a), εύρημα το οποίο αποκλείει την συμμετοχή τηςυπολιπιδαιμικής θεραπείας στο παραπάνω φαινόμενο. Ωστόσο, η απομάκρυνση της apo(a) με αναγωγική διάσπαση από το υπόλοιπο λιποπρωτεϊνικό σωματίδιο είχε σαν αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση της ενζυμικής ενεργότητας της PAF-AH στην Lp(a) των στεφανιαίων, ένα φαινόμενο το οποίο δεν παρατηρήθηκε στην Lp(a) των μαρτύρων. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα είναι πιθανό η πολυπεπτιδική αλυσίδα της apo(a) να επηρεάζει την ενεργότητα της PAF-AH στην Lp(a) των ασθενών με στεφανιαία νόσο μειώνοντας την ικανότητα αυτής να αποικοδομεί και να απενεργοποιεί φωσφολιπίδια με προφλεγμονώδη και προαθηρογόνο δράση. Λαμβάνοντας υπόψη ότι ο PAF εκτός από υπόστρωμα για την PAF-AH αποτελεί και ισχυρό αγωνιστή για τα αιμοπετάλια μελετήθηκε η επίδραση της Lp(a) στην ενεργοποίηση των κυττάρων αυτών με PAF. Σε πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια η Lp(a) ανέστειλε με δοσοεξαρτώμενο τρόπο τόσο την πρωτογενή συσσώρευση που προκαλεί ο PAF όσο και την δευτερογενή η οποία οφείλεται στη δράση αγωνιστών οι οποίοι εκκρίνονται από τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια. Η παρατηρούμενη αναστολή βρέθηκε να είναι αρκετά μικρότερη παρουσία του συστήματος CP/CPK και ασπιρίνης. Παράλληλα η Lp(a) ανέστειλε πλήρως την έκκριση του ΑΤΡ από τα πυκνά κοκκία αιμοπεταλίων που ενεργοποιήθηκαν με PAF. Το φαινόμενο αυτό δεν ήταν εξειδικευμένο έναντι της δράσης του PAF, αφού παρόμοια αναστολή παρατηρήθηκε και όταν ως αγωνιστές χρησιμοποιήθηκαν ADP και TRAP. Για να διευκρινισθεί ο τρόπος με τον οποίο επιτυγχάνεται η αναστολή που παρατηρήθηκε στα πειράματα της συσσωρευομετρίας, διερευνήθηκε με χρήση κυτταρομετρίας ροής η επίδραση της Lp(a) στην έκφραση του αιμοπεταλιακού υποδοχέα αι^β3 μετά από ενεργοποίηση με PAF. Είτε παρουσία είτε απουσία του συστήματος CP/CPK και ασπιρίνης παρατηρήθηκε αναστολή της έκφρασης του υποδοχέα αυτού παρουσία της Lp(a). j Στην συνέχεια θελήσαμε να διερευνήσουμε ποια από τα δομικά χαρακτηριστικά της <Lp(a) είναι υπεύθυνα για την εκδήλωση της βιολογικής (ανασταλτικής) της δράσης. > Για τον σκοπό αυτό έγινε παρασκευή πλυμένων αιμοπεταλίων. Βρέθηκε ότι η Lp(a)καθώς και η Lp(a-) ήταν ικανές να αναστείλουν σημαντικά τόσο την συσσώρευση όσο και την έκφραση του απυβ3 μετά από ενεργοποίηση με PAF, ένα φαινόμενο το οποίο δεν παρατηρήθηκε για την LDL. Προηγούμενη απενεργοποίηση της ενδογενούς PAF-AH δεν διαφοροποίησε την ανασταλτική δράση της Lp(a). Αντίθετα, όταν τα αιμοπετάλια ενεργοποιήθηκαν με TRAP τα σωματίδια Lp(a) και LDL παρουσίασαν παρόμοια σημαντική ανασταλτική δράση τόσο ως προς τησυσσώρευση όσο και ως προς την έκφραση του υποδοχέα am$3. Επιπλέον βρέθηκε ότι το σωματίδιο της Lp(a) ασκεί σημαντική αναστολή της πρόσδεσης του Fg-FITC σε αιμοπετάλια που ενεργοποιήθηκαν με ADP. Συμπερασματικά είναι πιθανό η Lp(a) να αναστέλλει την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων με ένα μη ειδικό μηχανισμό αναστέλλοντας την έκφραση του υποδοχέα am$3 καθώς και την πρόσδεση του Fg σ’αυτόν. Στην παραπάνω διαδικασία δεν φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο η apo(a) αλλά ούτε το περιεχόμενο της Lp(a) σε PAF-AH. Το παραπάνω εύρημαυποδεικνύει έναν νέο μηχανισμό με τον οποίο πιθανά η Lp(a) να συμμετέχει στην παθοφυσιολογία της θρόμβωσης.