Μελέτη της έκφρασης του mRNA του υποδοχέα της τρανσφερρίνης σε φυσιολογικά και νεοπλασματικά κύτταρα

Abstract

Transferrin receptor 1 (TfR1) is a type II transmembrane protein that mediates cellular iron uptake. In the serum, most iron exists in a transferrin-bound form. On the cell surface, iron bound transferrin binds to TfR1; this is followed by internalization of this complex. Recently, another receptor for transferrin, transferrin receptor 2 (TfR-2) has been cloned. At least 2 alternatively spliced forms of transcripts, α and β, are transcribed from the TfR-2 gene. TfR-2α protein is a type II membrane integrated glycoprotein similar to TfR-1 that can mediate iron uptake through transferrin. In this study, we evaluated mRNA expression of TfR1/TfR2, ferritin H-/-L-subunits and protein expression of TfR-1 and -2 in (i) a model system of human erythropoiesis, (ii) diagnostic bone marrow samples of 50 patients with acute myeloid leukemia, (iii) several myeloid cell lines. TfR1/ TfR-2α cDNA sequences were amplified in almost all samples (46/50 και 47/50, respectively); in contrast, TfR-2β mRNA was not detected in 13/50 analyzed cases. Moreover, 3 cases were negative for both ΤfR-1 και TfR-2 mRNA transcripts. Statistical analysis was carried out by the SPSS version 10.0 and the relationship between TfR-2 mRNA expression and FAB subyte, cytogenetic risk subgrouping and remission incidence did not show any significant correlation. ΤfR-1 mRNA transcripts were detected in all AML cell lines except the ΝΟΜΟ-1 (FAB-Μ5a) cell line. The highest level of TfR-1 mRNA was detected in ΜΟLM-16 (FAB-M0) and ΜV4-11 (FAB-M5) cells. TfR-2α mRNA transcripts were undetectable in ΜV4-11 (FAB-M5) cells, while moderate levels of both TfR-2α and TfR-2β transcripts were detected in the other AML cell lines. TfR-1 protein was highly expressed in all AML cells, except ΜΕ1 (FAB-Μ4eo). In contrast, TfR-2 protein was highly expressed only in ΜΟLM-16 και OCI-M1 (FAB-M6) cells, while in the other cell lines TfR-2 protein levels were very low. CD34+ erythroid precursors collected from peripheral blood samples of normal individuals were cultured in free serum StemSpan medium in the presence of SCF and erythropoietin. mRNA transcripts for TfR-1/TfR-2 were analyzed by qualitative and real-time quantitative PCR. Levels of TfR-1 and TfR-2α mRNA transcripts increased significantly during cell proliferation and erythroid maturation (days 3-9). TfR-2α mRNA transcripts slightly increased until day +12 and thereafter eventually decreased up to terminal differentiation. TfR-2β mRNA was highly expressed at the early stage of culture, followed by a gradual decrease up to terminal differentiation.TfR-1 and TfR-2α mRNA stability was analyzed in cultures treated with actinomycin-D (actD: 5μg/ml) for 24 and 48hrs on day 7 of culture (proerythroblast stage). The levels of both TfR-1 and TfR-2α mRNA transcripts increased by 4-6 –fold, respectively, in actD-treated-CD34+ cells. Western blotting experiments were performed with an anti-TfR-1-specific antibody on lysates derived from CD34+ cells throughout erythroid differentiation (days 3-14 of culture). These analyses demonstrated a significant increase in TfR1 protein levels throughout erythroid maturation -maximum levels on day 9 of culture. TfR-2 protein had the same expression pattern but in significantly lower levels. Assessment of H- and L-ferritin mRNA content at different stages of erythroid maturation demonstrated slightly higher levels of H-ferritin.These findings suggest that: (i) TfR-1 is highly expressed from early erythroid stages without significant changes throughout erythroid maturation in a context of progressively increasing transcription, alluding to predominantly post-transcriptional mode of regulation; (ii) TfR-2α expression is regulated by transcriptional as well as post-transcriptional mechanisms. These observations suggest that increased iron demands of developing erythroid cells might be met by consistently high expression of TfR-1 and –2 perhaps also mediated by Epo. With regard to myeloid cell lines and primary myeloid blasts, TfR-1 mRNA is detected in all hematopoietic cell lines and in almost all primary malignant myeloid cells. Besides, TfR-2 expression was detected on myeloid cell lines suggesting that TfR-2 is not an early erythroid marker. Moreover, the existence of TfR-1 and TfR–2 mRNA negative cases implies that AML blasts can also obtain iron through TfR- independent pathways.

Ο σίδηρος είναι απαραίτητος σε πολλές μεταβολικές διεργασίες του κυττάρου και η ομοιοστασία του είναι απαραίτητη για τον οργανισμό. Η μεταφορά του σιδήρου στο πλάσμα γίνεται με την τρανσφερρίνη. Τα περισσότερα κύτταρα προσλαμβάνουν το σίδηρο από την τρανσφερρίνη μέσω της πρόσδεσής της πάνω σε ειδικούς υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης (υποδοχείς τρανσφερρίνης/ Τransferrin receptor, TfR). Ο υποδοχέας τρανσφερρίνης -1 (TfR-1) εκφράζεται σε όλα τα κύτταρα εκτός από τα ώριμα ερυθροκύτταρα. Η έκφραση του γονιδίου TfR-1 ρυθμίζεται τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Ο υποδοχέας τρανσφερρίνης ΤfR-2 εμφανίζει δύο ισομορφές (α- και β-) λόγω διαφορετικού ματίσματος του αντίστοιχου mRNA. Σε αντίθεση με τον ΤfR-1, ο ΤfR-2 υποδοχέας εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ και στα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος. Στην παρούσα εργασία μελετήσαμε την έκφραση των μορίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό του σιδήρου (TfR-1, TfR-2, φερριτίνη –H/ -L) τόσο σε γονιδιακό όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο και τους μηχανισμούς που καθορίζουν την έκφραση αυτών σε φυσιολογικά και νεοπλασματικά κύτταρα της μυελικής σειράς. Συγκεκριμένα μελετήθηκε η έκφραση των παραπάνω μορίων σε αρχέγονα κύτταρα (CD34+) κατά τη διαφοροποίησή τους προς την ερυθρά σειρά, σε ασθενείς με οξεία μυελογενή λευχαιμία και σε μυελικές καρκινικές σειρές.Η έκφραση των γονιδίων ΤfR-1, TfR-2α, TfR-2β, φερριτίνη-H και φερριτίνη-L έγινε με RT-PCR, ενώ η ποσοτική έκφραση των παραπάνω γονιδίων προσδιορίστηκε με RQ-PCR “πραγματικού χρόνου”. Η μελέτη των μηχανισμών που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων αυτών και των αντίστοιχων πρωτεϊνών έγινε μετά την προσθήκη ακτινομυκίνης-D και κυκλοεξαμίδης στα CD34+ κύτταρα. Η μελέτη των πρωτεϊνών έγινε με Western Blot ανάλυση και η ποσοτικοποίηση με τη χρήση σαρωτή Εpson GT 8000 Laser. Η μελέτη των ασθενών με οξεία μυελογενή λευχαιμία (ΟΜΛ) έδειξε ότι η πλειονότητα των ασθενών εξέφραζαν ΤfR-1/ TfR-2α mRNA μετάγραφα (46/50 και 47/50, αντιστοίχως), ενώ 13/50 ασθενείς δεν είχαν έκφραση των TfR-2β mRNA μεταγράφων. Επίσης, σε 3/50 ασθενείς δεν ανιχνεύθηκαν ΤfR-1 και TfR-2 mRNA μετάγραφα. Η στατιστική ανάλυση των δειγμάτων δεν ανέδειξε σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ της απουσίας έκφρασης TfR-2β mRNA μεταγράφων με την ηλικία των ασθενών, τους ειδικούς κατά FAB υποτύπους, τις χρωμοσωμικές ανωμαλίες και την επίτευξη πλήρους ύφεσης. Σε όλες τις κυτταρικές σειρές οξείας μυελογενούς λευχαιμίας (ΟΜΛ) που εξετάσθηκαν, η έκφραση των TfR-1 mRNA μεταγράφων ήταν σχεδόν οικουμενική με εξαίρεση τη σειρά ΝΟΜΟ-1 (Μ5a κατά FAB). Η υψηλότερη έκφραση ΤfR-1 mRNA μεταγράφων παρατηρήθηκε στις κυτταρικές σειρές ΜΟLM-16 (M0 κατά FAB) και ΜV4-11 (M5 κατά FAB). H σειρά ΜΟLM-16 είχε επίσης τα υψηλότερα επίπεδα TfR-2α mRNA μεταγράφων, ενώ τα ΤfR-2β mRNA μετάγραφα κυμάνθηκαν σε χαμηλά επίπεδα. Στη σειρά ΜV4-11 (M5 κατά FAB) δεν ανιχνεύθηκαν ΤfR-2α mRNA μετάγραφα, ενώ στις υπόλοιπες κυτταρικές σειρές η έκφραση των TfR-2α και ΤfR-2β mRNA μεταγράφων κυμάνθηκε σε μέτρια επίπεδα.Σε πρωτεϊνικό επίπεδο, η έκφραση της TfR-1 πρωτεΐνης ήταν οικουμενική και σε υψηλά επίπεδα, με εξαίρεση τη σειρά ΜΕ1 (Μ4eo κατά FAB). Αντίθετα, η TfR-2 πρωτεΐνη ανιχνεύτηκε σε υψηλά επίπεδα μόνο στις σειρές ΜΟLM-16 και OCI-M1 (M6 κατά FAB), ενώ στις υπόλοιπες σειρές κυμάνθηκε σε χαμηλά έως μη ανιχνεύσιμα επίπεδα.Η έκφραση των γονιδίων ΤfR-1, TfR-2α, TfR-2β, φερριτίνη-H και φερριτίνη-L κατά τη διαφοροποίηση των αρχέγονων CD34+ κυττάρων έδειξε αύξηση των ΤfR-1 και TfR-2α mRNA μεταγράφων με μέγιστη έκφραση στο στάδιο της ερυθροβλάστης. Αντίθετα, τα TfR-2β mRNA μετάγραφα είχαν υψηλή έκφραση στην αρχή της καλλιέργειας και σταδιακά μειώθηκαν ακολουθώντας πρότυπο έκφρασης ανάλογο με εκείνο των mRNA μεταγράφων βαριάς και ελαφριάς αλυσίδας φερριτίνης. Οι ΤfR-1 και TfR-2 πρωτεϊνες έδειξαν παρόμοιο πρότυπο έκφρασης κατά την ερυθροειδική διαφοροποίηση των CD34+ κυττάρων, αν και τα επίπεδα του ΤfR-1 υποδοχέα ήταν υψηλότερα από τα αντίστοιχα του TfR-2. Oι φερριτίνες -Η και -L παρουσίασαν σημαντική αύξηση σε πρωτεϊνικό επίπεδο στο στάδιο της προερυθροβλάστης (3η-6η ημέρα καλλιέργειας). Η επίδραση τόσο της ακτινομυκίνης-D όσο και της κυκλοεξαμίδης έδειξε αύξηση τόσο των ΤfR-1 όσο και των TfR-2 mRNA μεταγράφων, ενώ σε επίπεδο πρωτεϊνών αύξηση παρουσίασε μόνο η ΤfR-1 και όχι η TfR-2 πρωτεΐνη. Από τη μελέτη των ασθενών και των μυελικών κυτταρικών σειρών με οξεία μυελογενή λευχαιμία προκύπτει ότι το γονίδιο TfR-2 δεν εκφράζεται αποκλειστικά και ειδικά μόνο στην ερυθρά σειρά μια και ισχυρή έκφραση βρέθηκε σε όλους τους κατά FAB υποτύπους. Οι πρωτεΐνες εισαγωγής του σιδήρου πιθανόν αλληλοσυμπληρώνονται στα βλαστικά κύτταρα ασθενών με ΟΜΛ και η απουσία TfR-1 και -2 σε 3 ασθενείς με ΟΜΛ δηλώνει ότι τα βλαστικά κύτταρα προσπορίζονται σίδηρο και μέσω οδών ανεξάρτητων από τους TfR υποδοχείς. Οι αυξημένες ανάγκες των διαφοροποιούμενων ερυθροκυττάρων για σίδηρο έχουν ως αποτέλεσμα την αυξημένη έκφραση του υποδοχέα TfR-1 από τα αρχικά στάδια διαφοροποίησης και παράλληλη έκφραση του TfR-2 (-α και –β) σε χαμηλότερα όμως επίπεδα σε συνδυασμό με την αυξημένη σταθερότητα των TfR-1 και TfR-2 mRNA μεταγράφων (α- και β- ισομορφές) στα πιο προχωρημένα στάδια ερυθροποίησης. Συνεπώς, η ρύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται στην ομοιοστασία του σιδήρου επιτυγχάνεται με τη δράση μεταγραφικών, μετα-μεταγραφικών και ενδεχομένως και μετα-μεταφραστικών μηχανισμών, ιδίως προς τα τελευταία στάδια διαφοροποίησης των ερυθροκυττάρων.