Μηχανισμός παραγωγής του παράγοντα αμβλύνσεως του κύματος των γοναδοτροφινών (Gonadotrophin surge attenuating factor - GnSAF) από τα κοκκώδη κύτταρα των ωοθηκών

Abstract

Introduction: Gonadotrophin Surge Attenuating Factor (GnSAF) is a nonsteroidal ovarian substance that in superovulated women attenuates the endogenous LH surge via a significant reduction of LH response to GnRH. According to previous studies, GnSAF, which is assumed to be produced byhuman granulosa cells under the influence of FSH, has a homology with the carboxyl terminal of the human serum albumin (HSA) protein. In an attempt to validate these findings, the whole or partial expression of FISA-gene was studied by RT-PCR analysis in human granulosa cells from womenundergoing in vitro fertilization treatment. Materials & Methods: RT-PCR analysis of HSA RNA transcripts was employed in luteinized granulosa cells in order to investigate the possible expression of the HSA gene. To ensure the specificity of PCR products, restriction enzyme and sequence analysis were performed. To further understand the underlying mechanism of the differential expression of HSA gene in granulosa cells, cytoplasmic and nuclear RNA were studied for HSARNA processing (removal of introns). Semi-quatification was used for comparison of the expression of the HSA gene fragments to that of -actin. Northern Blot analysis and in situ hybridization were performed as well, to further investigate the expression of the HSA gene by granulosa cells. Granulosa cells for in situ hybridization were cultured with or without the addition of FSH and the PCR product corresponding to the carboxyl terminal of HSA was used as probe. Western blot analysis was carried out to detect the possible expression of the albumin gene in granulosa cells.Results: RT-PCR and sequencing analysis of cDNA from granulosa cells revealed identical bands with those from the positive control for the amino as well as the carboxyl terminal corresponding to HSA gene at the cytoplasmic level. Semi-quatification analysis revealed expression of the amino as well as the carboxyl terminal of HSA gene from granulosa cells in comparative amounts to those from the HepG2 cells. The expression of the rest of the fragments was almost undetectable in the granulosa cells. PCR analysis for fragment from exon 12 to exon 13, cytoplasmic and total RNA from granulosa and HepG2 cells showed correctly spliced (containing no HSA IVS-12) transcripts, while DNA samples from these cells gave the unspliced fragments as expected. In Northern Blot analysis, correctly sized HSA mRNA transcripts, corresponding to the full transcript of HSA gene, were detected in HepG2 cells. The lack of detection of HSA message in granulosa cells suggest thatHSA is possibly expressed in limited amounts by granulosa cells, not detectable by this method. However, in situ hybridization showed expression of the carboxyl terminal of the HSA gene, in relative amounts to that showed in HepG2 cells. This expression was detected in granulosa cells that were cultured with the addition of FSH. In Western blot analysis, the protein extracts of human luteinized granulosa cells and the HepG2 cell line gave detectable bands of the HSA at the expected size of 65kDa but no other bands were determined. Conclusion: We have demonstrated that human granulosa cells express the carboxyl and amino terminal parts of the HSA gene in levels comparable to those found in human hepatocytes. In situ hybridization results implicit that this expression is probably induced in presence of FSH. It is suggested that the coding gene for GnSAF may be a result of an alternative splicing of HSAgene.

Εισαγωγή: Ο παράγοντας άμβλυνσης του κύματος των γοναδοτροφινών (Gonadotrophin Surge Attenuating Factor -GnSAF) είναι μια μη στεροειδής ωοθηκική ουσία, που μέσω μια σημαντικής μείωσης της ανταπόκρισης της υπόφυσης στη GnRFI αμβλύνει το ενδογενές κύμα της LFI σε γυναίκες, οι οποίες υποβάλλονται σε θεραπεία πρόκλησης πολλαπλής ωοθυλακιορρηξίας. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, ο GnSAF, του οποίου τόπος παραγωγής θεωρούνται τα ανθρώπινα κοκκώδη κύτταρα και η παραγωγή του επάγεται κυρίως από την FSFI, έχει ομολογία με το καρβοξυτελικό άκρο της ανθρώπινης λευκωματίνης (FISA). Με βάση τα παραπάνω η εργασία αυτή έχει σκοπό τη μελέτη του υπεύθυνου γονιδίου για τον παράγοντα GnSAF, έκφραση ολόκληρου ή μέρους του FISA γονιδίου από τα κοκκώδη κύτταρα γυναικών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία για εξωσωματική γονιμοποίηση (IVF). Υλικό και Μέθοδοι: FI ανάλυση των HSA mRNA μεταγράφων με RT-PCR έγινε σε ωχρινποιημένα κοκκώδη κύτταρα. Η ταυτοποίηση των προϊόντων PCR έγινε με περιοριστικές ενδονουκλεάσες και ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (sequencing). Για την κατανόηση του υποκείμενου μηχανισμού της έκτοπης αυτής έκφρασης του HSA γονιδίου στα κοκκώδη κύτταρα, μελετήθηκε η διαδικασία διασύνδεσης (απομάκρυνση εσονίων) σε δείγματα ολικού και κυτταροπλασματικού RNA. Ο ημι-ποσοτικός προσδιορισμός των τμημάτων του HSA γονιδίου έγινε σε σύγκριση με την έκφραση του γονιδίου της β-ακτίνης. Η ανάλυση κατά Northern και ο in situ υβριδισμός έγιναν με στόχο την επιπλέον διερεύνηση της έκφρασης του HSA γονιδίου από τα κοκκώδη κύτταρα. Η καλλιέργεια των κοκκωδών κυττάρων κατά τον in situ υβριδισμό έγινε παρουσία ή απουσία FSH και σημασμένος ανιχνευτής ήταν το προϊόν PCR, που αντιστοιχεί στο καρβοξυτελικό άκρο του HSA γονιδίου. Η ανάλυση κατά Western χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της πιθανής έκφρασης της πρωτεΐνης από τα κοκκώδη κύτταρα. Αποτελέσματα: Η ανάλυση των αποτελεσμάτων RT-PCR και την ταυτοποίηση των προϊόντων PCR στα κοκκώδη κύτταρα έδειξαν ίδιες ζώνες έδειξαν ότι στο κυτταρόπλασμα των κοκκωδών κυττάρων εκφράζεται το αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο του FiSA γονιδίου. FI ημι-ποσοτική ανάλυση έδειξε ότι τόσο το αμινοτελικό όσο και το καρβοξυτελικό άκρο του FISA γονιδίου, αντίθετα με την έκφραση των υπόλοιπων τμημάτων που είναι ελάχιστη, εκφράζονται από τα κοκκώδη κύτταρα σε συγκρινόμενες αναλογικά ποσότητες με αυτές από τα FlepG2 κύτταρα (θετικός μάρτυρας). FI ορθή διαδικασία της διασύνδεσης επιβεβαιώθηκε από την ύπαρξη σωστά μεταγραφόμενων FISA mRNA μεταγράφων (χωρίς εσόνια) στα κοκκώδη κύτταρα που αφορούν την περιοχή από το εξόνιο 12 έως το εξόνιο 13 του FISA γονιδίου. Στην ανάλυση κατά Northern, ανιχνεύθηκαν FISA mRNA μετάγραφα μόνο στα FlepG2 κύτταρα. FI απουσία εμφάνισης σήματος FISA στα κοκκώδη κύτταρα υποδηλώνει ότι η λευκωματίνη πιθανά εκφράζεται σε πολύ χαμηλά επίπεδα, μη ανιχνεύσιμα με αυτή τη μέθοδο. Ο in situ υβριδισμός παρουσία FSH έδειξε συγκρίσιμα επίπεδα έκφρασης του καρβοξυτελικού άκρου του FISA γονιδίου στα κοκκώδη κύτταρα με αυτά που εκφράζονται στα FlepG2 κύτταρα. Στην ανάλυση κατά Western, τα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα των ανθρώπινων ωχρινοποιημένων κοκκωδών κυττάρων και της κυτταρικής σειράς FlepG2 έδωσαν ζώνες μεγέθους 65 kDa, που αντιστοιχούν στο ορθό μέγεθος για την πρωτεΐνη FISA, χωρίς όμως την ανίχνευση περαιτέρω ζωνών.