Ανίχνευση και ποσοτικοποίηση της τελομέρασης σε άτομα προσβεβλημένα από τον ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) και συσχέτιση με τον τύπο του ιού

Abstract

The natural ends of chromosomes are called telomeres. During DNA replication telomeres are gradually shortened due to the “end replication problem”. This problem is being solved by telomerase, an enzyme which adds hexameric nucleotides repeats at the chromosome ends. The role of telomerase is to maintain the ends of chromosomes, so telomere lengths are extended or maintained and replicative senescence is avoided. Telomerase is composed of two major subunits contributing to its enzymatic activity, an RNA component (hTR) that serves as the template for the polymerase activity of the enzyme and a conserved catalytic subunit with reverse transcriptase activity (hTERT). A number of additional protein subunits, as well as a variety of proteins contributing to the assembly and maturation of the telomerase enzymatic complex have also beenidentified. Among these various telomerase components, hTR and hTERT are considered essential for reconstitution of telomerase activity. Although hTR is highly expressed in all tissues regardless of telomerase activity, with cancer cells having higher expression than normal cells, hTERT is presently considered to be the most important factor in the formation of functional telomerase and concomitant immortalization and is strongly associated with the enzyme’s activity. Most normal human somatic cells exhibit no detectable telomerase activity but highly proliferative cells and up to 85-90% of cancer cells, including cervical cancer cells show telomerase activity. Several geneticand epigenetic mechanisms exist which control the transcription of the hTERT gene, leading to repression or reactivation of telomerase activity in normal and cancer cells in a context-dependent manner. Among them several virus-encoded proteins have been suggested, which contribute to human cell transformation and carcinogenesis. Human papillomaviruses (HPV), especially high risk types 16 and 18, play an important role in immortalization and transformation of human ceratinocytes and their oncogenic activities are mainly attributed to the E6 and E7 oncoproteins. Also, analysis of the promoter region of hTERT gene has revealed the presence of a CpG island and a high overall GC content suggesting a possible role of methylation status in the regulation of hTERT expression. Cervical cancer is a major cause of death and the second most common cancerin women worldwide, while certain types of human papillomavirus (HPV) being etiologically related to the development of most cases of cervical cancer. Cervical cytologic abnormalities are categorized in atypical squamous epithelial cells of undetermined significance (ASCUS), low-grade squamous intraepithelial lesions (LGSILs) including condylomata acuminata and mild dysplasia as well as high-grade squamous intraepithelial lesions (HGSIL) including moderate to severe dysplasias and carcinoma in situ. In the present thesis telomerase and hTERT mRNA expression were studied in 45 normal and 280 abnormal cervical specimens and possible mechanisms concerning hTERT regulation were investigated, as the role of HPV-16 DNA viral load, E6/E7 mRNA expression and hTERT DNA promoter methylation. Moreover, in order to examine the clinical utility of the above parameters sensitivity, specificity, negative and positive predictive values were evaluated. Telomerase and hTERT mRNA expression levels were correlated with cytologic findings, HPV infection, HPV-16 DNA viral load and E6/E7 mRNA expression. Moreover, we observed an increase in hTERT DNA promoter methylation levels and the degree of dysplasia. In conclusion, our findings suggest that HPV infection either alone or in association with other insults activates the expression of the telomerase gene in the cervical mucosa. Telomerase activation and hTERT mRNA expression appears to be an early event in the malignant transformation of cervical epithelium, while, for the first time, we found that DNA promoter methylation does not seem to play any role in hTERT mRNA expression. Regarding the clinical utility of the above findings and based on our assessment values, we propose that quantitative hTERT mRNA could be used as an adjunctive marker to cervical cytology for HGSILs. However, it is suggested that the final evaluation of telomerase test performance must rely on a combination of all available test assessment data, cytologic and histologic diagnosis as well as the follow up of all women with low grade lesions that expressed telomerase activity.

Τα φυσικά άκρα των χρωμοσωμάτων ονομάζονται τελομερή. Κατά τη διάρκεια αντιγραφής του DNA και λόγω του «προβλήματος ολοκλήρωσης της αντιγραφής» τα τελομερή χάνουν σταδιακά το μήκος τους. Το πρόβλημα αυτό επιλύει η τελομεράση που έχει την ικανότητα να προσθέτει επαναλήψεις νουκλεοτιδίων στα άκρα των χρωμοσωμάτων διατηρώντας το μήκος των τελομερών και παρέχοντας στα κύτταρα τη δυνατότητα για απεριόριστο αριθμό διαιρέσεων. Πρόκειται για ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο, που αποτελείται από μία RNA υπομονάδα που λειτουργεί σαν εκμαγείο για τη σύνθεση συμπληρωματικού DNA (hTR), μία υπομονάδα με δράση αντίστροφης μεταγραφάσης (hTERT) και πλήθος άλλων πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν συμβάλλοντας στη δημιουργία ενός ενεργού ολοενζύμου. Παρόλο που η hTR εκφράζεται ανεξάρτητα από την ενεργότητα του ενζύμου, η hTERT διαδραματίζει θεμελιώδη ρόλο στην ενεργότητα του ολοενζύμου. Φυσιολογικά, έκφραση της τελομεράσης παρατηρείται στα γαμετικά κύτταρα, σε όλη τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης καθώς και σε φυσιολογικά κύτταρα που διαιρούνται συνεχώς, όπως σε αιμοποιητικά αρχέγονα κύτταρα, σε ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα, σε κύτταρα του μυελού των οστών κ.ά. Επιπλέον, έχει βρεθεί έκφραση του ενζύμου σε 85-90% των περιπτώσεων καρκίνου, συμπεριλαμβάνοντας και τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Η ρύθμιση της έκφρασης της hTERT και κατ'επέκταση και του ολοενζύμου πραγματοποιείται τόσο μέσω γενετικών όσο και επιγενετικών μηχανισμών. Ανάμεσά τους, σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης της φαίνεται να διαδραματίζουν οι Ε6 και Ε7 πρωτεΐνες του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV), ενώ η παρουσία μεγάλου αριθμού CpG νησιδίων τονίζει το πιθανό ρυθμιστικό ρόλο της μεθυλίωσης. Ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας αποτελεί το δεύτερο πιο συχνό καρκίνο παγκοσμίως και έχει συσχετιστεί με την παρουσία του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) και ειδικότερα με τα στελέχη 16 και 18. Ο ιός HPV προσβάλει τα επιθηλιακά κύτταρα της βασικής στοιβάδας του εξωτραχήλου και πιθανότατα επάγει την ενεργοποίηση της τελομεράσης. Οι μέχρι τώρα μελέτες έχουν δείξει αντιφατικά αποτελέσματα όσον αφορά την έκφραση της τελομεράσης και της hTERT τόσο σε καρκινικά όσο και σε προκαρκινικά τραχηλικά επιχρίσματα. Η διάγνωση των κυτταρολογικών ανωμαλιών πραγματοποιείται με το τεστ Παπανικολάου και η κατάταξη σύμφωνα με το σύστημα Bethesda περιλαμβάνει τα άτυπα πλακώδη κύτταρα απροσδιορίστου σημασίας (ASCUS), τα τραχηλικά επιχρίσματα με χαμηλού βαθμού δυσπλασία (LGSIL) και με υψηλού βαθμού δυσπλασία (HGSIL). Ωστόσο, λόγω της μικρής ειδικότητας του κυτταρολογικού τεστ, κρίνεται αναγκαία η εύρεση νέων διαγνωστικών δοκιμασιών που θα συμβάλλουν στην κλινική αντιμετώπιση των γυναικών με δυσπλασίες τραχήλου της μήτρας. Στη συγκεκριμένη διατριβή μελετήθηκε η έκφραση της τελομεράσης και της καταλυτικής υπομονάδας της (hTERT) σε 45 φυσιολογικά και σε 280 παθολογικά τραχηλικά επιχρίσματα με ποικιλία κυτταρολογικών ευρημάτων και διερευνήθηκαν πιθανοί μηχανισμοί που ενέχονται στη ρύθμιση της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης (hTERT), όπως ο ρόλος του ιϊκού και των Ε6 και Ε7 μεταγράφων του ιού HPV-16 καθώς και η μεθυλίωση του DNA του υποκινητή του γονιδίου hTERT. Ακόμη, προκειμένου να ελεχθεί η διαγνωστική ή προγνωστική αξία των παραπάνω παραμέτρων υπολογίστηκαν τα χαρακτηριστικά των διαγνωστικών δοκιμασιών: ευαισθησία, ειδικότητα, θετική προγνωστική τιμή και αρνητική προγνωστική τιμή. Παρατηρήσαμε συσχέτιση της μεταξύ της τελομεράσης και των επιπέδων έκφρασης της hTERT με τα κυτταρολογικά ευρήματα, την παρουσία του ιού HPV, τα επίπεδα του ιϊκού DNA και την ανίχνευση των ογκοπρωτεϊνών Ε6 και Ε7. Επίσης, διαπιστώσαμε αύξηση της μέσης τιμής των επιπέδων μεθυλίωσης του DNA του υποκινητή με την αύξηση του βαθμού δυσπλασίας, ενώ για πρώτη φορά δεν παρατηρήθηκε καμία συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης της καταλυτικής υπομονάδας της τελομέρασης και του ποσοστού μεθυλίωσης στον υποκινητή του γονιδίου hTERT. Από όλα τα παραπάνω ευρήματα διαπιστώνουμε ότι η μόλυνση με το ιό HPV δημιουργεί το κατάλληλο μεταλλαξογόνο περιβάλλον και επάγει μια σειρά από γεγονότα όπως η αύξηση των επιπέδων του ιϊκού φορτίου του HPV-16, η έκφραση των ογκοπρωτεϊνών Ε6 και Ε7, η έκφραση της τελομεράσης καθώς και η αύξηση των επιπέδων των μεταγράφων της καταλυτικής υπομονάδας της, που δημιουργούν κυτταρικές αλλαγές και επάγουν την καρκινογένεση, ενώ η μεθυλίωση στον υποκινητή της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης δε φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παραπάνω διαδικασία. Πιθανότατα άλλοι γενετικοί ή και επιγενετικοί μηχανισμοί ελέγχουν τη ρύθμιση της hTERT. Τέλος, σχετικά με την κλινική εφαρμογή των παραπάνω ευρημάτων, η χρήση του ποσοτικού προσδιορισμού της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης πιθανότατα θα μπορούσε να αποτελέσει διαγνωστικό δείκτη για την αντιμετώπιση των γυναικών με υψηλού βαθμού δυσπλασία, ενώ κρίνεται απαραίτητη η συνεχής παρακολούθηση των γυναικών με χαμηλού βαθμού δυσπλασία που είναι θετικές για τελομεράση. Η τελική εκτίμηση της αντιμετώπισης των γυναικών με δυσπλασίες του τραχήλου της μήτρας πρέπει να βασίζεται στην κλινική εικόνα σε συνδυασμό με το σύνολο των διαγνωστικών δοκιμασιών που ήδη υπάρχουν.