Time-resolved FTIR και ηλεκτροχημικές μελέτες των cbb3, aa3-600 και ba3 οξειδασών

Abstract

The aim of the present dissertation is the characterization of the structural and dynamic properties of the binuclear center upon binding of exogenous ligands as well as the determination of reduction potentials of cytochrome and quinol oxidases. FTIR and time-resolved step scan FTIR have been applied for the investigation of the structure and dynamics of the binuclear site of cytochrome cbb3-CO complex. The rates for the CuB-CO dissociation (t1/2 = 120 µs) and heme b3-CO recombination (t1/2 = 150 µs) we have determined in this study suggest that the rate limiting step for the heme b3 recombination of CO is the half-life of the CuB-CO complex. The time-resolved FTIR data reveal that in this cbb3-type oxidase the decay of the transient CuB-CO complex is concurrent with the formation of the heme b3-CO complex, and the ν(CO) of CuB at 2064 cm-1, despite the lack of the cross-link tyrosine 280, is similar to that observed in cytochrome aa3. As a first step in understanding the cytochrome cbb3/NO reaction is the characterization of the binuclear center upon NO binding. In this work we report the NO-bound form of oxidized cbb3 by Fourier tranform infrared spectroscopy (FTIR) and compare it with that of the heme b3 3+-NO complex of NOR, and the NO complex of metmyoglobin. The data reported here demonstrate that NO binding occursexclusively at the heme b3 center and not at CuB. The absence of a negative charge in the binuclear center of heme b3-CuB in conjunction with a more open pocket than in other heme-copper oxidases, lowers the energy barrier optimizing the efficiency of NO escape We report the first evidence for the formation of a mixed valence heme b Fe3+/Cu1+-CO complex at ambient temperature. This bimetallic center is the catalytic site of heme-copper oxidases where the O2, and in some cases, the NO reductions take place. We have used cytochrome oxidase cbb3 to demonstrate that addition of O2 to the fully reduced CO bound heme b Fe+2 enzyme oxidizes the heme b Fe and forms a Cu+1-CO complex. The ν(CO) frequency at 2047 cm-1 of the novel Cu+1-CO species is 16 cm-1 lower than that of the transient (t1/2=160 ms) heme Fe3+/Cu1+-CO (ν(CO)=2063 cm-1) species that is formed upon photodissociaton of CO from heme b Fe+2. The formation of such novel equilibrium mixed valence heme b Fe3+/Cu1+-CO complex is observed for the first time in any structurally known heme-copper oxidases and heme-Cu model compounds. Τime-resolved step scan FTIR has been applied for the investigation of the structure and dynamics of the binuclear site of αα3-600 from Bacillus subtilis. The results illustrate that that the dynamics of the heme a3 proximal pocket in not a possible explanation for the dissociation of CO from CuB and that distal effects play the dominant role in the recombination process. Our results are consistent with an activation barrier which prevents CO recombination to heme a3 and ligand removal from CuB occurs via escape into the surrounding solvent before binding to the heme a3. A model describing the photodissociation/association of ligands in the active site of the enzyme has been proposed. The spectroelectrochemical technique has been applied in order to determine the potentials of each of the redox centers of cytochrome cbb3. Moreover a comparison of the redox potential of heme b3 is being made between cytochrome cbb3 and the NO reductase so as to draw conclusions with regard to the heme environment before the reaction with the NO. The results show that complete reduction of the binuclear center of cytochrome cbb3 is thermodynamically favorable. This means that the mechanism of activation of NO occurs with a fully reduced binuclear centerb3/CuB. On the contrary the potential of heme b3 of NOR declares that the reduction of the binuclear center b3/FeB is not favorable from the physiologic donors of electrons. The spectroelectrochemical technique has been applied in order to determine the potentials of each of the redox centers of cytochrome ba3. The mechanism by which cytochrome ba3 reduces NO to N2O has not yet been clarified. As a first step in investigating this complicated mechanism, we have used the spectroelectrochemical technique in order to study the fully reduced ba3-NO complex. Knowing the number of electrons that we electrochemically give or extract, we are in a position to monitorspectroscopically the possible forms of ferrous heme a3, during the electrochemical oxidation of the fully reduced ba3-NO complex. The results indicate that cytochrome ba3 catalyzes the two-electron reduction of NO to N2O and that the oxidation of heme b is the rate-limiting step for the reduction of NO. These results may help us to elucidate the catalytic cycle of NO reduction by cytochrome ba3.

Ο στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι ο χαρακτηρισμός της δομής και της δυναμικής του διπυρηνικού κέντρου καθώς και ο προσδιορισμός των δυναμικών αναγωγής των κυτοχρωμικών και κινολικών οξειδασών. Σε αυτή την εργασία περιγράφεται η κινητική μελέτη του συμπλόκου cbb3-CO με την τεχνική της step-scan FTIR φασματοσκοπίας. Το κυτόχρωμα cbb3 είναι η μοναδική αιμοχαλκοξειδάση στην οποία η διάσπαση του CuB-CO συμπλόκου συνοδεύεται από το σχηματισμό του Fe-CO συμπλόκου. Τα time-resolved FT-IR φάσματα της φωτοδιάσπασης του CO στη cbb3 κυτοχρωμική οξειδάση δείχνουν ότι η ν(CO) δόνηση τάσης του CuB στους 2064 cm-1 είναι ίδια με εκείνη του κυτοχρώματος αα3 παρόλο που το κυτόχρωμα cbb3 δεν περιέχει το cross-link Ηis-Tyr244 και τη φαρνεσυλική αλυσίδα. Οι ταχύτητες που υπολογίσαμε για τη διάσπαση του CO από το CuB (t1/2 = 120 μs) και την επαναδέσμευση του στην αίμη b3 (t1/2 = 150 μs) δείχνουν ότι το καθοριστικό στάδιο για την επαναδέσμευση του CO στην αίμη b3 είναι ο αποσχηματισμός του CuB-CO συμπλόκου. Σαν ένα πρώτο βήμα για την κατανόηση της αντίδρασης του κυτοχρώματος cbb3 με το NO είναι ο χαρακτηρισμός του διπυρηνικού κέντρου κατά τη δέσμευση του ΝΟ. Γι αυτό το λόγο μελετήσαμε με φασματοσκοπία UV-Vis και FTIR τη δομή του υποκατεστημένου με ΝΟ κυτοχρώματος cbb3 και τη συγκρίνουμε με αυτή των ΝΟ-συμπλόκων της αναγωγάσης του ΝΟ (ΝΟR) και της μυοσφαιρίνης. Τα δεδομένα δείχνουν ότι το ΝΟ δεσμεύεται αποκλειστικά στην αίμη b3 και όχι στο CuB. Αυτή είναι η πρώτη δονητική μελέτη της δέσμευσης του ΝΟ σε αιμοχαλκοξειδάση που βρίσκεται στην οξειδωμένη κατάσταση. Η απελευθέρωση του ΝΟ από την αίμη b3 του cbb3 δείχνει ότι το περιβάλλον της αίμης b3 στο cbb3 είναι λιγότερο πολικό από αυτό της NOR και ότι η ανοιχτή δομή του διπυρηνικού κέντρου b3/CuB, συγκρινόμενη με τη κλειστή δομή του διπυρηνικού κέντρου b3/μη-αιμικός Fe του NOR, διευκολύνει τη θερμική απελευθέρωσή του. Στην εργασία αυτή αποδεικνύουμε για πρώτη φορά την ύπαρξη μιας μικτού σθένους αίμη Fe3+/Cu1+-CO δομή. Σε αντίθεση με όλες τις γνωστές αιμοχαλκοξειδάσες, παρουσιάζουμε εδώ άμεση απόδειξη ότι προσθήκη του Ο2 στο πλήρως ανηγμένο αίμη-Fe2+-CO σύμπλοκο αντικαθιστά το CΟ από την αίμη b Fe2+ παράγοντας ένα σταθερό αίμη Fe3+/Cu1+-CO διπυρηνικό σύμπλοκο. Αυτή η ανίχνευση του σε ισορροπία Cu1+-CO συμπλόκου, δεν έχει παρατηρηθεί προηγουμένως σε οποιαδήποτε δομικά γνωστά αιμοχαλκοξειδάση και μοντέλα αίμης- Cu. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήσαμε την φασματοσκοπία time-resolved step-scan FTIR για τη διερεύνηση της δομής και της δυναμικής του διπυρηνικού κέντρου του κυτοχρώματος αα3-600 του Bacillus subtilis. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι μεταβολές που συμβαίνουν στο εγγύς περιβάλλον της αίμης α3 δεν επηρεάζουν την αποδέσμευση του CO από το CuB. Επιπλέον δείχνουν ότι υπάρχει ένα ενεργειακό φράγμα το οποίο εμποδίζει την επαναδέσμευση του CO στην αίμη α3 και ότι η απόσπαση του CO από το CuB συμβαίνει μέσω της απελευθέρωσης του στο διαλύτη πριν επαναδεσμευθεί στην αίμη α3. Για την ερμηνεία των δεδομένων μας, προτείνουμε ένα μοντέλο για τη δυναμική του διπυρηνικού κέντρου a32+ /CuB1+ μετά τη φωτόλυση του CO Με τη φασματοηλεκτροχημική τεχνική προσδιορίσαμε τα δυναμικά αναγωγής των οξειδοαναγωγικών κέντρων του κυτοχρώματος cbb3. Στη συνέχεια γίνεται μια σύγκριση του δυναμικού αναγωγής της αίμης b3 ανάμεσα στο κυτόχρωμα cbb3 σχετικά με το περιβάλλον της αίμης πριν την αντίδραση με το ΝΟ. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η πλήρης αναγωγή του διπυρηνικού κέντρου στο ένζυμο αυτό είναι θερμοδυναμικά ευνοούμενη. Αυτό σημαίνει ότι ο μηχανισμός ενεργοποίησης του ΝΟ πραγματοποιείται με ένα πλήρως ανηγμένο διπυρηνικό κέντρο αίμης b3/CuB. Αντίθετα η τιμή του δυναμικού αναγωγής της αίμης b3 της NOR δηλώνει ότι η αναγωγή της αίμης του διπυρηνικού κέντρου είναι μη ευνοϊκή από τους φυσιολογικούς δότες ηλεκτρονίων. Ο μηχανισμός της αναγωγής του ΝΟ σε Ν2Ο που καταλύεται από το κυτόχρωμα bα3 δεν έχει και τη νιτρική αναγωγάση έτσι ώστε να εξάγουμε συμπεράσματα ακόμη διευκρινιστεί Σαν ένα πρώτο βήμα ως προς τη διερεύνηση αυτού του μηχανισμού χρησιμοποιήσαμε τη φασματοηλεκτροχημική τεχνική για να μελετήσαμε το σύμπλοκο του ανηγμένου κυτοχρώματος bα3 με το ΝΟ. Γνωρίζοντας τον αριθμό των ηλεκτρόνιων που δίνουμε ή αποσπούμε ηλεκτροχημικά, είμαστε σε θέση να εκτιμήσουμε τις πιθανές καταστάσεις δέσμευσης του υποκαταστάτη και την οξειδωτική τους κατάσταση, κατά την ηλεκτροχημική οξείδωση του πλήρως ανηγμένου συμπλόκου bα32+-ΝΟ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το κυτόχρωμα bα3 επιτελεί την καταλυτική ανάγωγη δύο ηλεκτρονίων του ΝΟ σε Ν2Ο και η οξείδωση της αίμης b αποτελεί το καθοριστικό στάδιο για την αναγωγή του ΝΟ.