Διατροφική παρέμβαση με σκόνη μαστίχας Χίου σε ζωικό μοντέλο ΙΦΝΕ (ιδιοπαθής φλεγμονώδης νόσος του εντέρου)

Abstract

Background: Chios mastic, a natural resin rich in terpenoids, possesses antioxidant, cardioprotective, anticancer and antimicrobial properties. A recent pilot study in patients with activeCrohn’s disease showed that mastic consumption ameliorated the disease activity index. However,this effect is not clear yet and the underlying mechanism of action has not been identified.Purpose: The aim of the present study was to investigate mastic’s antioxidant and anti-inflammatoryeffects: a) on animal experimental model that mimics Crohn’s disease and b) on inflammed humancolon epithelial cells that mimic inflammation in Crohn’s disease, in order to determine themechanism of action. Methods: In the first series of experiments, Chios mastic was administered in Wistar rats previously treated with intracolonic infusion of TNBS (trinitrobenzene sulfonic acid). TNBS induces damage in intestinal epithelium similar to that of Crohn’s disease patients. After 24 hours of TNBS treatment, mastic was administered in the form of powder dispersed in water by oral gavage at different concentrations and time periods. The results determined the optimum mastic dose and time of intervention. In the next series of experiments the same animal model was used according to experimental conditions determined by the 1st series of experiments. Animals were administered with mastic, as well as with mastic’s fractions (acidic, neutral) and oleanolic acid, the main triterpene of mastic. Colonic damage was assessed microscopically. Inflammation was estimated by measuring the levels of IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α and ΙCAM-1 in rat tissue and serum. Malonaldehyde concentration was used as a marker of oxidative stress. In order to determine the inflammation pathways that interfere with mastic, HT29 human colon epithelial cells were co-cultured with activated macrophages. Mastic’s effects were studied as regards to regulation of lactate dehydrogenase % release, production of IL-8 and NF-κB activation. Expression of IL-8 and ICAM-1 at mRNA level was measured in both rat epithelium and HT29 cells. Results: Administration of mastic at 100mg/Kg of body weight (BW) for a time period of 3 days improved colonic damage score (p<0.001), reduced the levels of all proinflammatory cytokines (p<0.05) and diminished malonaldehyde concentrations (p<0.001). Resin fractionization into acidic- (rich in terpenic acids) and neutral fraction (rich in terpenic alcohols and aldehydes) had no positive results. When these fractions were individually administered at doses contained in 100mg mastic/Kg of BW, levels of pro-inflammatory cytokines were decreased (p<0.05) even at transcriptional level (p<0.05). However, neither colonic damage nor malonaldehyde concentration did change. Oleanolicacid was also found to be ineffective. In whole, mastic has beneficial properties only whenadministered in its natural form. The results of the in vitro experiments showed that macrophagestrigger inflammation and induce cytotoxicity (p<0.001) in HT29 cells by increasing lactatedehydrogenase release. However, incubation of mastic with HT29 cells decreased cytotoxicity(p<0.001). Additionally, levels and expression of IL-8 decreased (p<0.001) via deactivation of NFκΒ (p<0.001). Conclusions: Chios mastic exerts potent antioxidant and anti-inflammatory effects on TNBSinduced colitic rats, via neutralizing the NF-κB inflammation cascade. Mastic’s properties are evident when administered in its natural form, since no effect was observed when fractions or oleanolic acid were individually administered. In conclusion, this unique product of Greek flora may be used in the near future for the treatment of inflammation, however further research is needed to confirm the beneficial effects of mastic, as well as its bioactive compounds.

Ανασκόπηση: Η μαστίχα Χίου, φυσική ρητίνη πλούσια σε τερπενοειδή, έχει αντιοξειδωτική, καρδιοπροστατευτική, αντινεοπλασματική και αντιμικροβιακή δράση. Σύμφωνα με πρόσφατη πιλοτική μελέτη, η πρόσληψή της βελτιώνει την κλινικο-εργαστηριακή εικόνα ασθενών με ενεργή νόσο Crohn. Ωστόσο, η δράση αυτή δεν έχει αποσαφηνιστεί και ο μηχανισμός δράσης παραμένει αδιευκρίνιστος. Σκοπός: Η διερεύνηση της αντιοξειδωτικής και αντιφλεγμονώδους δράσης της μαστίχας Χίου σε: α) ζωικό πρότυπο που μιμείται τη νόσο Crohn και β) κυτταρικό μοντέλο φλεγμονής του παχέος εντέρου που μιμείται τη νόσο Crohn, με σκοπό τη διευκρίνηση του μηχανισμού δράσης. Μεθοδολογία: Σε μια σειρά πειραμάτων, η μαστίχα χορηγείται σε επίμυες τύπου Wistar στους οποίους έχει προηγηθεί ενδοκολονική έγχυση τρινιτροβενζολοσουλφονικού οξέος (TNBS). Το τελευταίο προκαλεί αλλοιώσεις στο βλεννογόνο του παχέος εντέρου παρόμοιες με εκείνες της νόσου Crohn. Μετά το πέρας 24 ωρών από την έγχυση TNBS, η μαστίχα χορηγείται από του στόματος με τη βοήθεια καθετήρα ως εναιώρημα σε νερό. Οι επιδράσεις της εξετάζονται σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και χρονικές περιόδους. Από τα αποτελέσματα καθορίζεται η βέλτιστη δόση και χρονική περίοδος της διατροφικής παρέμβασης. Σε επόμενη σειρά πειραμάτων πραγματοποιείται παρέμβαση στο ίδιο ζωικό πρότυπο και στις συνθήκες που καθορίστηκαν από την 1η σειρά πειραμάτων. Η διατροφική παρέμβαση περιλαμβάνει τη διατροφή των πειραματόζωων με μαστίχα ως έχει, καθώς και με τα κλάσματά της (όξινο, ουδέτερο) και με το ολεανολικό οξύ, το κύριο τριτερπένιο της μαστίχας. Η βλάβη του εντερικού επιθηλίου αξιολογείται μικροσκοπικά. Για την αξιολόγηση της φλεγμονής μετρώνται οι IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α και ΙCAM-1 στον ιστό και ορό, ενώ η συγκέντρωση της μαλοναλδεΰδης στον ιστό χρησιμοποιείται ως δείκτης οξειδωτικού στρες. Ο μηχανισμός δράσης της μαστίχας διερευνάται σε μια 3η σειρά πειραμάτων, στην οποία πραγματοποιείται συγκαλλιέργεια επιθηλιακών κυττάρων παχέος εντέρου ανθρώπου (ΗΤ29) και ενεργοποιημένων μακροφάγων. Η κυτταρική βλάβη στα ΗΤ29 κύτταρα εκτιμάται με την %απελευθέρωση της γαλακτικής αφυδρογονάσης, ενώ η φλεγμονή με τη μέτρηση των επιπέδων της IL-8 και της ενεργοποίησης του πυρηνικού μεταγραφικού παράγοντα ΝF-κΒ. Η έκφραση των IL-8 και ICAM-1 μετράται τόσο στο εντερικό επιθήλιο των επίμυων όσο και στα ΗΤ29 κύτταρα. Αποτελέσματα: Η χορήγηση μαστίχας σε δόση ίση προς 100mg /Kg σωματικού βάρους (ΣΒ) για 3 ημέρες βελτιώνει την ιστική βλάβη (p<0.001), μειώνει τα επίπεδα όλων των προφλεγμονωδών κυτταροκινών στον ιστό (p<0.05) και ελαχιστοποιεί την έκκριση μαλοναλδεΰδης (p<0.001). Η κλασματοποίηση, ωστόσο, του προϊόντος σε όξινο (πλούσιο σε τερπενικά οξέα) και σε ουδέτερο κλάσμα (πλούσιο σε τερπενικές αλκοόλες και αλδεΰδες) δεν επιφέρει τα ίδια θετικά αποτελέσματα. Όταν τα δύο κλάσματα χορηγούνται χωριστά σε δόσεις που εμπεριέχονται στα 100mg μαστίχας/Kg ΣΒ, μειώνουν μεν την έκκριση των προφλεγμονωδών κυτταροκινών (p<0.05) ακόμη και σε επίπεδο mRNA (p<0.05), ωστόσο δεν βελτιώνουν ούτε την ιστική βλάβη, ούτε την έκκριση της μαλοναλδεΰδης. Επίσης, το ολεανολικό οξύ δεν έχει καμία επίδραση στους TNBS-επίμυες. Συνεπώς,η δράση της μαστίχας θα πρέπει να αποδίδεται σε δράση όλων των συστατικών της. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων in vitro δείχνουν ότι τα ενεργοποιημένα μακροφάγα πυροδοτούν τη φλεγμονή και αυξάνουν την κυτταροτοξικότητα (p<0.001) στα ΗΤ29 κύτταρα αυξάνοντας την απελευθέρωση της γαλακτικής αφυδρογονάσης. Επώαση των ΗΤ29 κυττάρων με μαστίχα αναστέλλει την κυτταροτοξικότητα (p<0.001). Επιπλέον, μειώνονται τα επίπεδα και η έκφραση της ΙL-8 (p<0.001), ενώ ταυτόχρονα απενεργοποιείται ο NF-κΒ (p<0.001). Συμπεράσματα: Η μαστίχα Χίου φαίνεται να έχει αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες στην TNBS-κολίτιδα, με πιθανό μηχανισμό την απενεργοποίηση του NF-κB, μορίου κλειδί στην πυροδότηση της φλεγμονής. Η μαστίχα φαίνεται να ασκεί τις ευεργετικές της δράσεις όταν χορηγείται στη φυσική της μορφή, καθώς κανένα από τα κλάσματά της ή το ολεανολικό οξύ δεν βρέθηκε να δρα ευεργετικά από μόνο του. Συνεπώς, το μοναδικό αυτό προϊόν της Ελληνικής χλωρίδας θα μπορούσε στο μέλλον να χρησιμοποιηθεί για την αντιμετώπιση της φλεγμονής, ωστόσο περαιτέρω μελέτες πρέπει να διεξαχθούν προκειμένου να επιβεβαιώσουν τις ευεργετικές της δράσεις, αλλά και να διευκρινίσουν τα βιοδραστικά συστατικά της.