Χαρακτηρισμός των μικροοργανισμών που αναπτύσσονται σε θαλάσσια ιζήματα στη ζώνη κρυστάλλων υδριτών μεθανίου.

Abstract

In Anaximander Mountains, in Eastern Mediterranean Sea, at a water depth of 1260-2000m., several active mud volcanoes have been identified that emit methane to the water column. Inside the sediment, in shallow depths, pressure and temperature favor gas hydrate formation, accumulating upward migrating methane, which may at the same time represent a possible source of methane emission, in case of destabilization due to changing conditions. High methane concentrations have been identified in the water column over these mud volcanoes. Methane emitted through the sediment is diluted in the water column, where methane oxidation rapidly occurs by methanotrophs. The remaining amount of methane is released to the atmosphere, increasing atmospheric methane budget, which contributes to the greenhouse effect.In sediments rich in methane, methanotrophs are thought to oxidize methane under anaerobic conditions, through a procedure that remains vague up to date. The Anaerobic Oxidation of Methane (AOM) in marine sediments, is thought to consume more than 80% of methane produced in marine sediments, which otherwise would end up to the water column. Methane that is finally emitted to the water column is what has not been sequestered in gas hydrates, and has not been consumed by methanotrophs.Previous investigations of AOM in Amsterdam and Kazan MV’s have provided information on the presence of anaerobic methanotrophs in the upper sediment layers. Up to date though, there has not been investigated the particular structures (aggregates) that these microorganism form, and their ecologic relations with other microorganisms. In the present study, the prokaryotic abundance has been estimated in sediment cores from Amsterdam, Kazan and Kula mud volcanoes, in depth up to 150cm. In these sediments, the occurrence of AOM activity was investigated and it was examined how fluid flow and methane hydrate formations affected it. At the same time, vivid cultures of sulfate reducing Bacteria and unknown Bacteria, probably methylotrophs, were generated from sediments retrieved from these mud volcanoes and Thessaloniki mud volcano. AOM was thoroughly investigated in Amsterdam mud volcano. High resolution sampling up to 44cm sediment depth, in a core retrieved from a low fluid flow site, revealed that cell abundance increased with depth. Two anaerobic methanotrophs were identified, ANME-1 and ANME-2 Archaea. The group of ANME-2 Archaea was found to form aggregates with sulfate reducing Bacteria of the Desulfosarcina/Desulfococcus cluster (DSS). These aggregates were detected in all examined depths, but a peak in aggregate abundance was detected at 32cm depth, where they accounted for 96% of total cell counts (5,19x109 cells cm-3 w.s.), implying intense AOM. At this depth, ANME-2/DSS aggregates were very large in size (12-15μm), and comprised of several thousands of cells. At 44cm depth, a second zone with high aggregate abundance was detected, with aggregates up to 5μm in diameter, accounting for 41% to total cell counts. The detection of aggregates of such size implies that AOM is active and constant for a long period of time. ANME-1 cells were detected at 14cm and deeper, and their concentration was found to increase with depth with a maximum at 38cm depth (1,17x108 cells cm-3 w.s.). Consequently, in the core AX02BC1, AOM was widespread throughout the length of the core. There was a zone though between 32 and 44cm which may be characterized as “zone of increased AOM”, which represents a microbial filter that prevents methane emission to the water column. Nothing similar occurred in core AX09GC1 also retrieved from Amsterdam MV, but from a high venting side. Geochemical date revealed the presence of a large methane hydrate formation in the middle of the core. In this core, cell abundance was high at 2 and 95cm sediment depth (108 cells cm-3 w.s.) where ANME-1 and ANME-2/DSS aggregates were detected, while on the contrary, in the sediment layers adjacent to the layer where the hydrate was detected, the “zone of hydrate formation”, cell abundance was one order of magnitude lower, probably because microorganisms are unable to inhabit inside the hydrate formation. The detection of ANME at 2 and 95cm depth, the layers adjacent to the “hydrate zone”, is an evidence of AOM occurrence, of low intensity though since these methanotrophs only constituted 29% and 14% of cell abundance at these depths, respectively.In the other sediment cores retrieved from Amsterdam MV, Kazan MV and Kula MV, from high venting sites, cell abundance was high at 2cm depth, ranging between 1,7 and 2,91x108 cells cm-3 w.s., and was decreasing with depth. With the exception of two more cores (AX11GC1 and AX23GC1), there was no evidence of AOM occurrence in the other cores examined. In AX11GC1 from Amsterdam MV, low aggregate concentration was detected in all examined depths, accounting for only 3-9% of total cells, which may be considered as low AOM activity. In all these cores, cell abundance was low at the depths were methane concentration was high or hydrates occurred. In core AX23GC1 from Kazan MV, at 39cm sediment depth, cell abundance was high (4,15x108 κύτταρα cm-3 ν.ιζ.) and cell aggregates were detected, accounting for 78% of total counts, which may be considered as evidence of AOM.Although in sediments above methane hydrates where methane flow is low, AOM was widespread throughout the core, this was not observed in sediments retrieved from high fluid flow sites. In these sediments, the conditions probably do not favor the inhabitance of methanotrophs. If AOM is active, it will most probably be located in narrow zones that create ecological niches inside the sediment, above or below the zone of hydrate formation. Sulfate reducing Bacteria (SRB) of the DSS cluster were enriched in cultures from various sediment depths, even from depths were sulfate normally should be depleted, implying that sulfate reduction was widespread and might be active at low sulfate concentrations. SRB were also retrieved in cultures from sediment depths were no occurrence of AOM was detected At these depths, SRB probably are involved in the anaerobic degradation of organic matter. There was no evidence of methanogenesis through the methylotrophic pathway.

Στην Ανατολική Μεσόγειο, στα υποθαλάσσια όρη Αναξίμανδρου, σε βάθος μεταξύ 1260 - 2030m από την επιφάνεια της θάλασσας, έχουν εντοπιστεί ενεργά ηφαίστεια ιλύος από τα οποία εκλύεται μεθάνιο στην υδάτινη στήλη. Πολύ ρηχά μέσα στο ίζημα, οι συνθήκες πίεσης και θερμοκρασίας που επικρατούν επιτρέπουν το σχηματισμό υδριτών μεθανίου, που αποτελεί μια μορφή συσσώρευσης του εκλυόμενου από τα βαθύτερα στρώματα μεθανίου, αλλά ταυτόχρονα και μια πιθανή πηγή απελευθέρωσης μεθανίου σε περίπτωση αποσταθεροποίησής τους, λόγω μεταβολής των συνθηκών. Υψηλές συγκεντρώσεις μεθανίου έχουν ανιχνευθεί στην υδάτινη στήλη, πάνω από τα ηφαίστεια αυτά. Το μεθάνιο που εκλύεται από το ίζημα διαλύεται στην υδάτινη στήλη, όπου ξεκινάει άμεσα η οξείδωσή του από μεθανιότροφους μικροοργανισμούς. Η ποσότητα που απομένει, διαφεύγει στην ατμόσφαιρα, όπου συνεισφέρει στην αύξηση του παγκόσμιου ατμοσφαιρικού φορτίου σε μεθάνιο, παράγοντας που συμβάλλει στο φαινόμενο του θερμοκηπίου. Στα πλούσια σε ιζήματα μεθάνιο, μεθανιότροφοι μικροοργανισμοί έχει βρεθεί ότι οξειδώνουν το μεθάνιο αναερόβια, σε μια διεργασία που μέχρι και σήμερα παραμένει αδιευκρίνιστη. Η αναερόβια οξείδωση του μεθανίου (ΑΟΜ) στα θαλάσσια ιζήματα θεωρείται ότι καταναλώνει περισσότερο από το 80% της ποσότητας του μεθανίου, που διαφορετικά θα διέφευγε στην υδάτινη στήλη. Η ποσότητα του μεθανίου που τελικά εκλύεται στην υδάτινη στήλη, είναι το μεθάνιο το οποίο δεν έχει συσσωρευτεί σε υδρίτες, και δεν έχει καταναλωθεί από τους μεθανιότροφους μικροοργανισμούς. Η διερεύνηση της ΑΟΜ στα ηφαίστεια ιλύος Amsterdam και Kazan από προηγούμενες μελέτες, έχει δώσει πληροφορίες για την παρουσία αναερόβιων μεθανιότροφων μικροοργανισμών στα ανώτερα επίπεδα του ιζήματος. Όμως μέχρι σήμερα, δεν είχαν διερευνηθεί οι ιδιαίτερες δομές που σχηματίζουν οι μεθανιότροφοι μικροοργανισμοί και οι οικολογικές τους σχέσεις με άλλους μικροοργανισμούς. Με την παρούσα εργασία, εκτιμήθηκε η κυτταρική αφθονία σε πυρήνες ιζήματος από τα ηφαίστεια ιλύος Amsterdam, Kazan και Kula σε βάθος μέχρι 150 cm και διερευνήθηκε εάν η ΑΟΜ είναι ενεργή και πως μπορεί να επηρεάζεται από την εκλυόμενη ροή και τους σχηματισμούς υδριτών, ενώ αναγεννήθηκαν καλλιέργειες θειικοαναγωγικών Bacteria, και άγνωστων Bacteria πιθανόν μεθυλιότροφων από τα ηφαίστεια αυτά και το ηφαίστειο ιλύος Thessaloniki.Στον πυρήνα ΑΧ02BC1 από περιοχή χαμηλής ροής έκλυσης ιλύος του ηφαιστείου ιλύος Amsterdam, η δειγματοληψία υψηλής ανάλυσης σε βάθος μέχρι 44cm, αποκάλυψε ότι η κυτταρική αφθονία αυξάνονταν με το βάθος. Δύο τύποι μεθανιότροφων μικροοργανισμών ανιχνεύθηκαν, τα ANME-1 και τα ΑΝΜΕ-2 Archaea. Τα ΑΝΜΕ-2 βρέθηκαν να σχηματίζουν συσσωματώματα μαζί με θειικοαναγωγικά Bacteria της ομάδας Desulfosarcina/Desulfococcus (DSS). Τα συσσωματώματα αυτά ανιχνεύθηκαν σε όλα τα βάθη του ιζήματος, με μέγιστη αφθονία στα 32 cm, όπου αποτελούσαν το 96% της κυτταρικής αφθονίας (5,19x109 κύτταρα cm-3 ν.ιζ.), γεγονός που υποδηλώνει έντονη δραστηριότητα ΑΟΜ. Στο βάθος αυτό τα ΑΝΜΕ-2/DSS συσσωματώματα είχαν μεγάλη διάμετρο (12-15μm), αποτελούμενα από μερικές χιλιάδες κύτταρα. Στα 44cm, βάθος ήταν η δεύτερη ζώνη με υψηλή αφθονία των ΑΝΜΕ-2/DSS συσσωματωμάτων, με συσσωματώματα διαμέτρου ~5μm, που συνεισέφεραν σε ποσοστό 41% στην ολική αφθονία. Η ανίχνευση μεγάλων συσσωματωμάτων υποδηλώνει ότι η διεργασία της ΑΟΜ ήταν ενεργή και συνεχής για μεγάλο χρονικό διάστημα. Τα ΑΝΜΕ-1 κύτταρα, ανιχνεύθηκαν σε βάθος κάτω από τα 14cm, και η συγκέντρωσή τους βρέθηκε ότι αυξάνονταν με το βάθος, με μέγιστη συγκέντρωση στα 38cm (1,17x108 κύτταρα cm-3 ν.ιζ.). Επομένως, στον πυρήνα ΑΧ02BC1, η ΑΟΜ ήταν εκτεταμένη σε όλα το βάθος του. Υπήρξε όμως μια ζώνη μεταξύ 32 και 44cm που μπορεί να θεωρηθεί ως «ζώνη αυξημένης ΑΟΜ», ένα μικροβιακό φίλτρο που αποτρέπει την έκλυση μεθανίου προς την υδάτινη στήλη.Δεν παρατηρήθηκε κάτι αντίστοιχο στον πυρήνα ΑΧ09GC1, επίσης από το ηφαίστειο ιλύος Amsterdam, που ανακτήθηκε από περιοχή με υψηλή ροή έκλυσης ιλύος και τα γεωχημικά δεδομένα αποκάλυψαν ότι υπήρχε μεγάλος υδρίτης στο μέσο του. Στον πυρήνα αυτό, η κυτταρική αφθονία ήταν υψηλή στα 2 και στα 95cm (της τάξης του 108 κύτταρα cm-3 ν.ιζ.), όπου ανιχνεύθηκαν ΑΝΜΕ-1 και ΑΝΜΕ-2/DSS συσσωματώματα, ενώ αντίθετα στα δύο παρακείμενα βάθη του επιπέδου που βρέθηκε ο υδρίτης, που μπορεί να θεωρηθεί ως «ζώνη σχηματισμού υδριτών», η κυτταρική αφθονία ήταν μια τάξη μεγέθους χαμηλότερη, ενδεχομένως λόγω της αδυναμίας των μικροοργανισμών να αναπτυχθούν στο εσωτερικό των υδριτών. Η παρουσία των ΑΝΜΕ στα 2 και στα 95cm, αποτελεί ένδειξη ότι συνέβαινε ΑΟΜ, εκατέρωθεν της «ζώνης υδριτών» με μέτρια δραστηριότητα όμως, καθώς οι μεθανιότροφες αυτές ομάδες αποτελούσαν μόλις το 29% και το 14% της ολικής κυτταρικής αφθονίας αντίστοιχα. Στους υπόλοιπους πυρήνες που ανακτήθηκαν από το ηφαίστειο ιλύος Amsterdam, Kazan και Kula, από περιοχές υψηλής ροής έκλυσης μεθανίου, η κυτταρική αφθονία ήταν υψηλή στα 2cm βάθος και κυμάνθηκε μεταξύ 1,7 και 2,91x108 κύτταρα cm-3 ν.ιζ, ενώ βρέθηκε ότι μειώνονταν με το βάθος. Με εξαίρεση δύο ακόμα πυρήνες (ΑΧ11GC1 και AX23GC1), στους υπόλοιπους δεν προέκυψαν ενδείξεις ότι μπορεί να συμβαίνει ΑΟΜ. Στον πυρήνα ΑΧ11GC1 από το ηφαίστειο ιλύος Amsterdam, ανιχνεύθηκε χαμηλή συγκέντρωση συσσωματωμάτων σε όλα τα βάθη, που αντιστοιχούσε μόλις στο 3-9% της ολικής κυτταρικής αφθονίας και μπορεί να θεωρηθεί ως ένδειξη ΑΟΜ χαμηλής δραστηριότητας. Στον ΑΧ23GC1 από το ηφαίστειο ιλύος Kazan, στα 39cm βάθος η ολική κυτταρική αφθονία ήταν υψηλή (4,15x108 κύτταρα cm-3 ν.ιζ.) και ανιχνεύθηκαν συσσωματώματα που αποτελούσαν το 78% της ολικής κυτταρικής αφθονίας που μπορεί να θεωρηθεί ως ένδειξη ΑΟΜ. Αν και σε ιζήματα όπου η εκλυόμενη ροή μεθανίου ήταν χαμηλή παρατηρήθηκε ότι η ΑΟΜ ήταν εκτεταμένη σε μια μεγάλη ζώνη μέσα στο ίζημα, κάτι τέτοιο δεν διαπιστώθηκε σε ιζήματα από περιοχές με υψηλή εκλυόμενη ροή ή σε ιζήματα που περιείχαν άφθονους κρυστάλλους μεθανίου. Στα ιζήματα αυτά ενδεχομένως οι γεωχημικές συνθήκες είναι ασταθείς επηρεάζοντας την εγκατάσταση των μεθανιότροφων μικροοργανισμών. Εάν συμβαίνει ΑΟΜ πολύ πιθανό εντοπίζεται σε συγκεκριμένους ορίζοντες μέσα στο ίζημα, πάνω ή κάτω από τη ζώνη σχηματισμού υδριτών όπου το ιδιαίτερο γεωχημικό μικροπεριβάλλον ευνοεί την ανάπτυξη των ΑΝΜΕ.Θειικοαναγωγικά Bacteria που ανήκαν στα DSS ανακτήθηκαν σε καλλιέργειες από διάφορα βάθη, ακόμα και από επίπεδα του ιζήματος όπου τα θειικά ιόντα θα έπρεπε να είχαν εξαντληθεί, υποδηλώνοντας ότι η αναγωγή των θειικών ήταν εκτεταμένη κι ενδεχομένως ενεργή και σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις θειικών ιόντων. Τα θειικοαναγωγικά Bacteria ανακτήθηκαν και από βάθη ιζήματος όπου δεν προέκυψαν ενδείξεις παρουσίας μεθανιότροφων μικροοργανισμών. Στα βάθη αυτά η παρουσία τους μάλλον συνδέεται με την αναερόβια αποικοδόμηση της οργανικής ύλης. Δεν προέκυψαν ενδείξεις από τις καλλιέργειες ότι η μεθανιογένεση ήταν ενεργή μέσο του μεθυλιοτροφικού μονοπατιού.