Διερεύνηση του ρόλου της φυσικής ανοσίας στην παθογένεια λοιμώξεων με εντεροΐούς

Abstract

More than 90% of coxsackievirus infections progress subclinically and they rarely cause life-threatening illness. Coxsackieviruses A are responsible for mild upper respiratory illness, while coxsackieviruses Β have been associated with severe or even lethal diseases, including acute myocarditis and acute aseptic meningitis, as well as chronic diseases such as dilated cardiomyopathy. It is generally accepted that specific coxsackievirus serotypes can cause specific clinical disorders. CVB3 is involved in 63% of myocarditis cases and may lead to dilated cardiomyopathy, whereas CVB4 has been implicated in the pathogenesis of insulin-dependent diabetes mellitus. Toll-like receptors are transmembrane proteins structurally related to the Toll receptor of Drosophila. They are innate immunity sensors which recognize conserved pathogen-associated molecular patterns, endogenous cellular ligands and synthetic components. They consist of an extracellular domain that recognize the ligands and an intracellular domain that contributes to the activation of signaling pathways. Ten different human TLRs have been identified. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) result from point mutations. The Tlr4 gene has two non-synonymous polymorphisms at amino acid locations Asp299Gly and Thr399Ile of the extacellular domain of TLR4 due to the substitution of aspartic acid from glycine and the substitution of threonine from isoleukine, respectively. Asp299Gly and Thr399Ile are found at a frequency of 1-10% in the general population. It is shown that the increased TLR4 production is associated with enterovirus replication and high viral RNA and TLR4 mRNA levels are correlated with the development of viral myocarditis and dilated cardiomyopathy. Also, it is demonstrated that CVB3 infection leads to an increase of TLR4 expression in macrophages, which are activated to produce proinflammatory cytokines in myocardium, while CVB4 triggers the production of cytokines in human pancreatic cells through a TLR4-dependent pathway. According to the above studies, it is implied that the TLR4 dysfunction could be a predisposing factor for the development enteroviral infections. These two polymorphisms could affect the docking surface structure and reduce the interaction affinity between the receptor and its ligand. In order to determine if the high frequency of Coxsackievirus infections is related with the increased appearance of TLR4 polymorphisms, we studied serologically the prevalence of Coxsackieviruses B throughout Greece. Traditionally, many clinical laboratories use the serum neutralization assay, a laborious procedure that requires the existence of “live” virus in cell culture, for the determination of Coxsackievirus. ELISA assay has been applied in serological diagnosis, but its value is limited due to the frequently observed cross-reactions among antigens from different coxsackievirus serotypes and other enteroviruses. In order to develop an immunosorbent assay with the ability to discriminate among different coxsackievirus serotypes, peptides which mimic a non-conserved amino-terminal epitope of the capsid protein VP1 of coxsackieviruses were synthesized. These peptides were chosen because they include amino acid sequences that discriminate different Coxsackie virus serotypes. The analysis of reactivity of serum samples from healthy blood donors against the three synthetic peptides indicated that the reactivities of positive samples detected using anti-peptide ELISAs can be easily discriminated from the ones observed with anti-CVB1/B5 ELISA. For the majority of sera, anti-CVB3pep and anti-CVB4pep reactivities were distinct and antigen specific. However, a group of sera exhibited high reactivity against both peptides, suggesting a correlation of CVB3pep and CVB4pep recognition. The comparison of the virus neutralization test and our ELISA assays data demonstrated that anti-CVB3pep and anti-CVB4pep activity were resided mainly among the sera possessing anti-CVB3 and anti-CVB4 neutralizing antibodies. Titration and evaluation of avidity of IgG antibodies against CVB4pep, CVB3pep and CVA24pep epitopes in polyreactive sera, evaluation of the specificity of peptide-antibody interactions with homologous and heterologous inhibition assays, affinity purification of specific anti-peptide antibodies and evaluation of their specificity were carried out. From the above experiments, it was concluded that the majority of sera possess antibodies that recognize one of CVB3pep, CVB4pep or CVA24pep peptides with antigen specific way. However, some sera seem to possess an antibody subpopulation which is reactive with all three peptides. In this case, anti-CVA24 IgG antibodies recognize only the CVA24pep. Anti-CVB4 and -CVB3 IgG antibodies are either antigen specific (homotypic antibodies) or recognize both peptides (heterotypic antibodies) but with different avidity. It is possible that the antiCVB3 is the initial specificity of homotypic antibodies, whereas the anti-CVB4 reactivity occurs as a result of cross-reactions with conserved structures on CVB4pep. The assay was applied to a large number of blood donors from six different blood donation sites of Greece. Antibodies against CVB4 were detected to a greater extent in Athens and antibodies against CVB1/B5 in Iraklio/Crete. Taking into account that TLR4 is implicated in the detection of enterovirus replication, it was examined whether Asp299Gly and Thr399Ile SNPs in TLR4 are associated with the occurrence of enterovirus-induced meningoencephalitis. The study group consists of samples from pediatric patients with enterovirus-induced meningoencephalitis while the control group comprises of samples from 40 healthy blood donors. Genomic DNA was isolated from CSF and blood samples and specific TaqMan PCR was applied. The majority of samples come from people who are homozygous for the wild type allele. This allele represents the normal situation, where no polymorphism is observed at amino acid locations Asp299Gly and Thr399Ile of the extacellular domain of TLR4 receptor. From the 40 healthy individuals, only one blood donor displays high fluorescence for the stimulated fluorophore ΤΕΤ and bears both SNPs in heterozygous state in 2,3%. Two of the 44 pediatric patients with enteroviral meningitis possess both polymorphisms in heterozygous state, as it was confirmed from DNA sequencing experiments. The samples which have Asp299Gly polymorphism, they, also, come up with Thr399Ile polymorphism due to the linkage disequilibrium which is observed in the European population. Despite the higher frequency of polymorphisms observed in pediatric patients with enteroviral meningitis compared to the frequency of polymorphisms in healthy blood donors, the TLR4 polymorphisms are not correlated, at a statistically significant level, to the appearance of enterovirus-induced meningoencephalitis, at least for that number of samples.

Περισσότερο από το 90% των λοιμώξεων που προκαλούνται από ιούς Coxsackie εμφανίζουν υποκλινική διαδρομή και σπάνια προκαλούν απειλητική για τη ζωή νόσο. Οι ιοί Coxsackie Α προκαλούν ήπιες λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος, ενώ οι ιοί Coxsackie Β σχετίζονται με σοβαρότερες ή ακόμα και θανατηφόρες νόσους, όπως η οξεία μυοκαρδίτιδα και η οξεία άσηπτη μηνιγγίτιδα, καθώς και με χρόνιες νόσους, όπως η διατατική καρδιομυοπάθεια. Συγκεκριμένοι ορότυποι των ιών Coxsackie μπορούν να προκαλέσουν συγκεκριμένες κλινικές διαταραχές. Έτσι, o ιός Coxsackie B3 εμπλέκεται στο 63% των περιπτώσεων μυοκαρδίτιδας και μπορεί να οδηγήσει στην εμφάνιση διατατικής μυοκαρδιοπάθειας ενώ ο ιός Coxsackie B4 ενοχοποιείται ότι ενέχεται στην παθογένεση του διαβήτη τύπου Ι. Οι Toll-like υποδοχείς είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες δομικά ομόλογες με τον Toll υποδοχέα της Drosophila. Αποτελούν αισθητήρες της φυσικής ανοσίας που αναγνωρίζουν συντηρημένα μοριακά πρότυπα παθογόνων μικροοργανισμών, ενδογενή κυτταρικά στοιχεία και συνθετικές ουσίες. Διαθέτουν μια εξωκυττάρια περιοχή, που εμπλέκεται στην αναγνώριση του παθογόνου παράγοντα, και μια κυτταροπλασματική περιοχή, μέσω της οποίας γίνεται ενεργοποίηση οδών μεταγωγής μηνυμάτων. Στον άνθρωπο έχουν αναγνωριστεί 10 TLRs. Οι πολυμορφισμοί ενός νουκλεοτιδίου (single nucleotide polymorphisms, SNPs) προκύπτουν κατά την αντικατάσταση ενός νουκλεοτιδίου από ένα άλλο. Στο γονίδιο του TLR4 έχουν ταυτοποιηθεί δύο μη συνώνυμοι πολυμορφισμοί που αντιστοιχούν στη θέση 299 και 399 της εξωκυττάριας περιοχής του TLR4. Ο Asp299Gly προκύπτει κατά την αντικατάσταση του ασπαρτικού οξέος από γλυκίνη και ο Thr399Ile από την αντικατάσταση θρεονίνης από ισολευκίνη. Οι πολυμορφισμοί Asp299Gly και Thr399Ile του TLR4 απαντώνται με συχνότητα εμφάνισης 1-10% στο γενικό πληθυσμό. Έχει δειχθεί ότι η αυξημένη έκφραση του TLR4 σχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό των εντεροϊών και τα υψηλά επίπεδα RNA τόσο των ιών όσο και του TLR4 σχετίζονται με την εμφάνιση ιογενούς μυοκαρδίτιδας και διατατικής μυοκαρδιοπάθειας. Ακόμη, έχει διαπιστωθεί ότι η λοίμωξη με ιό Coxsackie B3 οδηγεί σε αύξηση της έκφρασης του TLR4 στα μακροφάγα, η οποία ενεργοποιεί τα κύτταρα αυτά έτσι ώστε να παράγουν προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες στον καρδιακό οστό, ενώ η Coxsackie B4 επαγώμενη παραγωγή κυτταροκινών σε παγκρεατικά κύτταρα πραγματοποιείται με τη μεσολάβηση του TLR4. Σύμφωνα με τις παραπάνω μελέτες προκύπτει ότι η δυσλειτουργία του TLR4 θα μπορούσε να αποτελέσει προδιαθεσικό παράγοντα για την εμφάνιση λοιμώξεων που προκαλούνται από εντεροϊούς. Οι δύο πολυμορφισμοί μπορούν να προκαλέσουν διαταραχή της δομής που συνιστά την επιφάνεια επαφής με πιθανή συνέπεια τη μειωμένη συγγένεια αλληλεπίδρασης του υποδοχέα με τον συνδέτη. Προκειμένου να διαπιστώσουμε αν η αυξημένη συχνότητα λοιμώξεων από ιούς Coxsackie συσχετίζεται με αυξημένη εμφάνιση πολυμορφισμών στους Toll-like υποδοχείς, χρειάστηκε να προσδιοριστεί ο επιπολασμός των ιών Coxsackie στην Ελληνική Επικράτεια. Παραδοσιακά, πολλά κλινικά εργαστήρια χρησιμοποιούν τη μέθοδο της οροεξουδετέρωσης, μια επίπονη διαδικασία που απαιτεί την ύπαρξη του ενεργού ιού σε καλλιέργεια, για τον προσδιορισμό του οροτύπου των ιών Coxsackie σε διάφορα κλινικά δείγματα. Η τεχνική ELISA έχει εφαρμοστεί στην ορολογική διάγνωση, αλλά η χρήση της περιορίζεται λόγω των συχνών διασταυρούμενων αντιδράσεων με αντιγόνα που προέρχονται από άλλους εντεροϊούς. Προκειμένου να αναπτύξουμε ανοσοενζυμική τεχνική στερεάς φάσης με δυνατότητα διάκρισης αντισωμάτων έναντι διαφορετικών οροτύπων των ιών Coxsackie, σχεδιάστηκαν και παρασκευάστηκαν συνθετικά πεπτίδια που μιμούνται ένα μη συντηρημένο επίτοπο της αμινοτελικής περιοχής της καψιδικής πρωτεΐνης VP1 των ιών Coxsackie, ο οποίος έχει επιλεχθεί γιατί περικλείει αλληλουχίες που διαφοροποιούν τους οροτύπους των ιών Coxsackie. Η μελέτη της δραστικότητας των ορών υγιών αιμοδοτών έναντι των τριών πεπτιδίων έδειξε ότι οι δραστικότητες που προκύπτουν από τις αντι-πεπτιδικές ELISA είναι αντιγονικά διακριτές από αυτές που παρατηρούνται κατά την εμπορική αντιCVB1/B5 ELISA. Ξεκάθαρη διάκριση υπήρξε ανάμεσα στις δραστικότητες αντι-Coxsackie A24 και αντι-Β3 ή αντι-Β4. Για την πλειονότητα των ορών, οι αντι-Β3 και αντι-Β4 δραστικότητες ήταν ξεχωριστές. Όμως για μια υπομονάδα ορών, οι δραστικότητες αυτές βρέθηκαν να σχετίζονται στατιστικά σημαντικά. Η σύγκριση της αντιπεπτιδικής δραστικότητας με την ειδικότητα προσδιορισμού εξουδετερωτικών αντισωμάτων έδειξε ότι η αντι-CVB3pep και αντι-CVB4 δραστικότητα παρατηρείται κυρίως μεταξύ των ορών που φέρουν εξουδετερωτικά αντισώματα έναντι των ιών CVΒ3 και CVB4 Πραγματοποιήθηκε, ακόμη, τιτλοποίηση και εκτίμηση της συνάφειας των αντιπεπτιδικών IgG αντισωμάτων σε ορούς με υψηλή δραστικότητα έναντι των τριών πεπτιδίων, έλεγχος της ειδικότητας αναγνώρισης των πεπτιδίων με πειράματα ομόλογης και ετερόλογης αναστολής, καθαρισμός ειδικών αντιπεπτιδικών αντισωμάτων με χρωματογραφία ανοσοσυγγένειας και εκτίμηση της δραστικότητας των κεκαθαρμένων αντισωμάτων έναντι των τριών πεπτιδίων οδήγησαν στα παρακάτω συμπεράσματα. Από τα παραπάνω πειράματα διαπιστώθηκε ότι η πλειονότητα των ορών διαθέτει αντισώματα που αναγνωρίζουν ένα από τα πεπτίδια CVB3pep, CVB4pep ή CVA24pep με αντιγονοειδικό τρόπο. Ωστόσο, υπάρχουν ορισμένοι οροί που διαθέτουν αντισώματα τα οποία αναγνωρίζουν και τα τρία πεπτίδια. Στην περίπτωση αυτή, τα αντι-CVA24 IgG αντισώματα αναγνωρίζουν μόνο το CVA24pep. Τα αντι-CVB4 και αντι-CVB3 IgG αντισώματα είτε αναγνωρίζουν αποκλειστικά το αντιγόνο-στόχο τους (ομοτυπικά αντισώματα) είτε αναγνωρίζουν και τα δύο πεπτίδια (ετεροτυπικά αντισώματα) αλλά με διαφορετική συνάφεια. Πιθανώς η αντι-CVB3 είναι η αρχική δραστικότητα των ομοτυπικών αντισωμάτων, ενώ η αντι-CVB4 δραστικότητα των ιδίων αντισωμάτων φαίνεται να είναι αποτέλεσμα διασταυρούμενης αντίδρασης με συντηρημένες περιοχές στο ομόλογο CVB4pep. Η τεχνική που αναπτύξαμε εφαρμόστηκε σε μεγάλο αριθμό αιμοδοτών από έξι κέντρα αιμοδοσίας της Ελλάδας, όμως δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική προτίμηση του ιού για συγκεκριμένη γεωγραφική περιοχή εκτός της Αθήνας για τους Coxsackie B4 και της Κρήτης για τους Coxsackie B1/B5. Προχωρήσαμε στη μελέτη της ύπαρξης των δύο πολυμορφισμών του TLR4 και τη διερεύνηση της συσχέτισης των δύο αυτών πολυμορφισμών του TLR4 με την εμφάνιση λοιμώξεων από εντεροϊούς και ιδιαίτερα με την εμφάνιση μηνιγγίτιδας. Ως ομάδα μελέτης χρησιμοποιήσαμε δείγματα από παιδιατρικές κλινικές ασθενών με ιογενή μηνιγγίτιδα από εντεροϊούς ενώ ως ομάδα ελέγχου δείγματα από 40 υγιείς αιμοδότες. Ακολούθησε απομόνωση γενετικού υλικού και εφαρμογή αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου με τη μέθοδο TaqMan. Η πλειοψηφία των δειγμάτων που μελετήθηκαν προέρχεται από άτομα που είναι ομόζυγα για το αλληλόμορφο αγρίου τύπου που αντιπροσωπεύει τη φυσιολογική κατάσταση κατά την οποία δεν παρατηρείται πολυμορφισμός στις θέσεις 299 και 399 της εξωκυττάριας περιοχής του TLR4 υποδοχέα. Μόνο ένας αιμοδότης παρουσιάζει έντονο φθορισμό για το διεγερμένο φθορόχρωμα ΤΕΤ και φέρει και τους δυο πολυμορφισμούς σε ετερόζυγη κατάσταση σε ποσοστό 2,5%. Δύο από τους 44 παιδιατρικούς ασθενείς με μηνιγγίτιδα από εντεροϊούς φέρουν και τους δύο πολυμορφισμούς σε ετερόζυγη μορφή, όπως επιβεβαιώθηκε και από τα αποτελέσματα του προσδιορισμού της αλληλουχίας των τμημάτων DNA που είναι πιθανό να φέρουν τους πολυμορφισμούς. Τα δείγματα που φέρουν τον πολυμορφισμό Asp299Gly φέρουν επίσης τον πολυμορφισμό Thr399Ile του TLR4 λόγω της ανισορροπίας διασύνδεσης που παρατηρείται στον Ευρωπαϊκό πληθυσμό (Καυκάσιοι). Παρότι παρατηρείται αυξημένη συχνότητα εμφάνισης των πολυμορφισμών στους παιδιατρικούς ασθενείς με μηνιγγίτιδα από εντεροϊούς σε σύγκριση με τη συχνότητα εμφάνισης των πολυμορφισμών σε υγιείς αιμοδότες, δεν φαίνεται, τουλάχιστον για το συγκεκριμένο αριθμό δειγμάτων, να φτάνει σε στατιστικά σημαντικό επίπεδο η συσχέτιση της ύπαρξης των δύο πολυμορφισμών του TLR4 με την εμφάνιση μηνιγγοεγκεφαλίτιδας από εντεροϊούς.