Προσδιορισμός βιοδοκιμών και βιοδεικτών για την εκτίμηση της ποιότητας ανακτημένων εκροών εγκαταστάσεων επεξεργασίας αστικών λυμάτων

Abstract

The main aim of this thesis was the assessment of bioassays and biomarkers that do not reflect toxicity, but are able to estimate wastewater treatment effectiveness (different methods of disinfection and tertiary treatment) through total effluent’s activity in in vitro and in vivo systems. The determination of physicochemical and microbiological characteristics of the effluents revealed ozonation, combined with tertiary treatment or not, as the most effective process to improve the quality of the effluent. It is also proved that wet sterilization by autoclave leads to a significant reduction of the chemical as well as the microbial load of all the effluents. Furthermore, high levels of endotoxin were detected in the secondary treated samples while their removal depended on the treatment method applied. In vitro experiments revealed the mitogenic response of primary mouse spleenocytes as well as the cytokines produced (IL-1, IL-10 and TNFα), as a sensitive bioassay and biomarker respectively, able to detect in the effluents the presence and the activity of endotoxin, even in very low levels. Furthermore, MTT viability assay applied in HepG2 cells was successfully used to determine the effectiveness of effluent disinfection and tertiary treatment. HepG2 cells, cultured in media prepared with effluents, were activated and their metabolic activity increased. In vivo experimentation showed that water administration (depending on the treatment performed), induced pathoanatomical corruptions, leading to gut barrier perturbation, as well as, increased the number of enterocytes producing or expressing homeostatic parameters associated with the gastrointestinal mucosa. The effect of reclaimed water, observed in gut mucosa, could be transferred in blood cells. Our experiments showed that reclaimed water containing pollutants is able to activate intracellular homeostatic mechanisms in the mononuclear blood cells. This activation results in the induction of stress proteins, such as a1-acid glycoprotein (AGP) and metallothionein (MT), as well as post-translational modifications, such as AGP glycosylation and MT polymerism. On the other hand, the administration of reclaimed water doesn’t seem to induce a systemic acute phase response, since the levels of the acute phase proteins (AGP, CRP, a1-antitrypsin, albumin) are not affected. The above data indicate the sensitivity of the gut mucosa and the post-transcriptional modifications in the evaluation of the reclaimed water. The successive application of the above in vitro and in vivo systems is proposed in order to estimate the total effect of the reclaimed water. Furthermore, the results of this thesis show that the bioassays and biomarkers should be used in combination in order to assess liquid environmental samples since different components of the samples affect different systems.

Στόχος της διατριβής ήταν ο προσδιορισμός ευαίσθητων βιοδεικτών και βιοδοκιμών, που δεν σχετίζονται με τοξικότητα, αλλά είναι ικανοί να εκτιμήσουν την αποτελεσματικότητα της επεξεργασίας των εκροών, που προέκυψαν έπειτα από την εφαρμογή μεθόδων απολύμανσης και τριτοβάθμιας επεξεργασίας, μέσω της συνολικής τους δράσης σε in vitro και in vivo συστήματα. Ο προσδιορισμός των φυσικοχημικών και μικροβιολογικών χαρακτηριστικών των εκροών έδειξε ότι ο οζονισμός με ή χωρίς τριτοβάθμια επεξεργασία αποτελεί την αποτελεσματικότερη μέθοδο, από αυτές που δοκιμάστηκαν και βρίσκονται σε εφαρμογή σήμερα, για τη βελτίωση της ποιότητας των εκροών. Στη διατριβή αυτή παρουσιάζονται αποτελέσματα που δείχνουν ότι η υγρή αποστείρωση των επεξεργασμένων δειγμάτων σε αυτόκαυστο αποτελεί μία μέθοδο που μειώνει σημαντικά τόσο το χημικό όσο και το μικροβιολογικό φορτίο των εκροών. Παρουσιάζονται επίσης αποτελέσματα που δείχνουν την παρουσία υψηλών επιπέδων ενδοτοξίνης στις δευτερογενώς επεξεργασμένες εκροές, η απομάκρυνση της οποίας εξαρτάται από τη μέθοδο επεξεργασίας που εφαρμόζεται. Ο in vitro πειραματισμός ανέδειξε τη μιτογονική απόκριση των πρωτογενών σπληνοκυττάρων ποντικού και τις κυτοκίνες (IL-1, IL-10 και TNFα) που παράγονται ως κατάλληλη και ευαίσθητη βιοδοκιμή ή βιοδείκτη αντίστοιχα, ικανών να προσδιορίζουν την παρουσία και δράση της ενδοτοξίνης στις εκροές ακόμη και μετά από μεγάλη αραίωσή τους εκεί που άλλες μέθοδοι προσδιορισμού τοξικότητας αδυνατούν. Επιπλέον, in vitro πειράματα προσδιορισμού της βιωσιμότητας των κυττάρων ηπατικής προέλευσης, της σειράς HepG2, μέσω του μεταβολισμού του ΜΤΤ, ανέδειξαν αυτή τη μέθοδο επίσης ως μία ευαίσθητη βιοδοκιμή για της εκτίμηση της ποιότητας των επεξεργασμένων εκροών. Η καλλιέργεια των HepG2 σε θρεπτικό υλικό που παρασκευάστηκε με ανακτημένο νερό εκροών οδήγησε σε διέγερση των κυττάρων και αύξηση της μεταβολικής τους δραστηριότητας. Ο in vivo πειραματισμός έδειξε ότι η χορήγηση των παραπάνω αποστειρωμένων δειγμάτων σε επίμυες προκαλεί αύξηση του αριθμού των κυττάρων που παράγουν ή εκφράζουν παραμέτρους που σχετίζονται με την ομοιόσταση του γαστρεντερικού βλεννογόνου. Η επίπτωση στον εντερικό βλεννογόνο είναι δυνατό να μεταφερθεί στο αίμα και τα πειράματά μας έδειξαν ότι το ανακτημένο νερό εκροής που φέρει φορτίο μπορεί να ενεργοποιήσει τόσο την αύξηση ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών καταπόνησης όπως της α1-όξινης γλυκοπρωτεΐνης (AGP) και της μεταλλοθειονίνης (MT) όσο και σε μετα-μεταφραστικές αλλαγές τους όπως του βαθμού γλυκοσυλίωσης της AGP ή του πολυμερισμού της μεταλλοθειονίνης MT. Από την άλλη, δεν έδειξε να διεγείρει το ήπαρ και να επάγει μία γενικευμένη απόκριση οξείας φάσης, εφόσον τα επίπεδα των πρωτεϊνών οξείας φάσης. που προσδιορίστηκαν (AGP, AT, CRP, αλβουμίνη) δε μεταβάλλονται. Το γεγονός αυτό ενισχύει την ευαισθησία χρησιμοποίησης του εντερικού βλεννογόνου αλλά και της μετα-μεταφραστικής αλλαγής σε πρωτεΐνες καταπόνησης για την αξιολόγηση της ποιότητας του ανακτημένου νερού εκροής. Προτείνεται η διαδοχική εφαρμογή των παραπάνω in vitro και in vivo δοκιμών και παρέχεται έτσι η δυνατότητα της συνολικής εκτίμησης της επίπτωσης του ανακτημένου νερού, ανεξάρτητα από τα επιμέρους συστατικά του, δίνοντας μία σαφέστερη εικόνα όσον αφορά την ποιότητα και την καταλληλότητά του. Ακόμη, δεδομένου ότι κάθε ένα από τα συστήματα που εφαρμόστηκε εμφανίζει διαφορετική ευαισθησία σε διαφορετικά συστατικά του κάθε δείγματος, για την απόκτηση μιας ολοκληρωμένης εικόνας θα πρέπει οι παραπάνω βιοδείκτες και βιοδοκιμές να εφαρμόζονται σε συνδυασμό και όχι μεμονωμένα.