Ορθολογικός σχεδιασμός και σύνθεση αναστολέων φωσφολιπασών Α2

Abstract

Phospholipases Α₂ (PLA₂) are a superfamily of enzymes, which are characterised by their ability to catalyse the hydrolysis of the sn-2 ester bond of membrane phospholipids. The products of the PLA₂ activity are free fatty acids, including arachidonic acid, and lysophospholipids. These products are further metabolised to form a variety of pro-inflammatory lipid mediators, called eicosanoids, which are involved in various inflammatory diseases. The rational design, the synthesis and the elucidation of the binding of potent and selective inhibitors contribute to the elucidation of the functions of PLA₂ enzymes and to the development of new anti-inflammatory drugs. In the first chapter of this thesis, the four main categories of PLA₂ enzymes are described. The second chapter, summarises the molecular modeling methods, which are used on the in silico drug design. The aim of this thesis was the rational design and the synthesis of phospholipases A₂ inhibitors (Ch. 3). 2-Oxoamide and amide derivatives, containing a free carboxyl group, have been synthesised (Ch. 4). These compounds, including some other compounds, which have been synthesised at the Laboratory of Organic Chemistry at the University of Athens, have been tested for their inhibitory activity against GIIA sPLA₂. Thereafter, the elucidation of the stereoelectronic factors that affect the inhibitory activity of these compounds was achieved using the docking algorithm GOLD (Ch. 5). The design of PLA₂ inhibitors using Three-Dimensional Quantitative Structure-Activity Relationship (3D-QSAR) methods is described in the sixth chapter. In this study, a data set of 34 indole inhibitors with known in vitro % inhibitory activity against GIIA sPLA₂, have been used. All the indole inhibitors have been docked in the enzyme active site using the docking algorithm GLIDE. Then, the resulted-best-score pose for each ligand has been used for the generation of a 3D-QSAR CoMFA model. During the last stage of the research for the design of PLA₂ inhibitors, the binding of 2-oxoamide inhibitors in the active site of GIVΑ cPLA₂ have been studied (Ch. 7). For the docking of the 2-oxoamide inhibitors, the algorithm Surflex-Dock has been used. The most active inhibitor has been scored with the highest-calculated-binging affinity. The elucidation of the stereoelectronic factors that affect the inhibitory activity of the 2-oxoamide inhibitors was achieved. Thereafter, Molecular Dynamics simulations on two of the resulted with Surflex-Dock enzyme-ligand complexes have been performed, in order to examine the stability of the complexes. By concluding this study, the binding of a new class of compounds containing heterocyclic rings has been studied. These compounds may be potential inhibitors of GIVA cPLA₂ enzyme.

Οι φωσφολιπάσες Α₂ (PLA₂) αποτελούν μία υπεροικογένεια ενζύμων, που χαρακτηρίζονται από την ικανότητα τους να καταλύουν την υδρόλυση του εστερικού δεσμού στην sn-2 θέση των φωσφολιπιδίων των μεμβρανών, παράγοντας ελεύθερα λιπαρά οξέα και λυσοφωσφολιπίδια. Τα προϊόντα της καταλυτικής δράσης των PLA₂ ενζύμων αποτελούν πρόδρομες ενώσεις για την παραγωγή εικοσανοειδών, τα οποία θεωρείται ότι εμπλέκονται ως μεσολαβητές σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις φλεγμονής. Συνεπώς, ο σχεδιασμός, η σύνθεση και η διευκρίνιση του τρόπου δράσης ισχυρών και εκλεκτικών αναστολέων των PLA₂ ενζύμων συντελεί στην αποσαφήνιση των λειτουργιών τους και στην ανακάλυψη νέων φαρμάκων για την καταπολέμηση φλεγμονωδών ασθενειών. Στο πρώτο κεφάλαιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής περιγράφονται οι τέσσερεις κύριες ομάδες των PLA₂ ενζύμων. Στο δεύτερο κεφάλαιο συνοψίζονται οι μέθοδοι μοριακής μοντελοποίησης που χρησιμοποιούνται στον in silico ορθολογικό σχεδιασμό. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν ο ορθολογικός σχεδιασμός και η σύνθεση αναστολέων φωσφολιπασών Α2 (Κεφ. 3). Αρχικά συντέθηκαν 2-οξοαμιδικά και αμιδικά παράγωγα, τα οποία περιέχουν ελεύθερη ομάδα καρβοξυλίου (Κεφ. 4). Οι ενώσεις αυτές, μαζί με άλλες ενώσεις που συντέθηκαν στο Εργαστήριο Οργανικής Χημείας του Πανεπιστημίου Αθηνών, δοκιμάστηκαν για την ανασταλτική τους δράση έναντι της GIIA sPLA₂. Στη συνέχεια με χρήση του αλγόριθμου μοριακής πρόσδεσης GOLD πραγματοποιήθηκε προσπάθεια να γίνουν κατανοητοί οι στερεοηλεκτρονικοί παράγοντες που επηρεάζουν την ανασταλτική δράση των ενώσεων αυτών έναντι του ενζύμου (Κεφ. 5). Στο έκτο κεφάλαιο αναφέρεται ο σχεδιασμός αναστολέων φωσφολιπασών Α₂ με χρήση Τρισδιάστατων Ποσοτικών Σχέσεων Δομής-Δράσης (3D-QSAR). Για το σκοπό αυτόν χρησιμοποιήθηκε ένα σύνολο από 34 ινδολικούς αναστολείς, για τους οποίους υπήρχαν βιβλιογραφικά δεδομένα της in vitro % ανασταλτικής τους δράσης έναντι της GIIA sPLA₂. Αρχικά όλοι οι αναστολείς προσδέθηκαν στο ενεργό κέντρο της GIIA sPLA₂ χρησιμοποιώντας τoν αλγόριθμο GLIDE. Ο προσανατολισμός κάθε αναστολέα στο ενεργό κέντρο του ενζύμου που υπολογίστηκε από το GLIDE, χρησιμοποιήθηκε για την εξαγωγή του μοντέλου 3D-QSAR CoMFA. Ολοκληρώνοντας την έρευνα για το σχεδιασμό αναστολέων φωσφολιπασών Α₂, μελετήθηκε ο τρόπος πρόσδεσης 2-οξοαμιδικών αναστολέων της GIVΑ cPLA₂, στο ενεργό κέντρο του ενζύμου (Κεφ. 7). Για τη μελέτη Μοριακής Πρόσδεσης των 2-οξοαμιδοκών αναστολέων χρησιμοποιήθηκε ο αλγόριθμος Surflex-Dock. Ο αναστολέας που παρουσίαζε τη μεγαλύτερη in vitro ανασταλτική δράση, βαθμολογήθηκε με τη μεγαλύτερη συγγένεια πρόσδεσης. Από τη μελέτη εξήχθησαν χρήσιμα συμπεράσματα για τους στερεοηλεκτρονικούς παράγοντες που επηρεάζουν την ανασταλτική δράση των ενώσεων αυτών. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν πειράματα προσομοίωσης Μοριακής Δυναμικής σε δύο από τα συμπλέγματα που προέκυψαν από την πρόσδεση με το Surflex-Dock για να μελετηθεί η σταθερότητα των συμπλεγμάτων. Ολοκληρώνοντας την ερευνητική αυτή εργασία, μελετήθηκε η πρόσδεση μιας νέας ομάδας ενώσεων που φέρουν ετεροκυκλικούς δακτυλίους, οι οποίες μπορεί να αποτελέσουν πιθανούς αναστολείς της GIVA cPLA₂.