Απομόνωση, μοριακός χαρακτηρισμός και επιδημιολογική μελέτη ελληνικών στελεχών mycobacterium avium subspecies paratuberculosis από πρόβατα, αίγες και μονογαστρικά είδη της άγριας πανίδας

Abstract

The introductory chapter of this thesis considers the available literature on the role of wildlife as a reservoir for Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) infection of domestic ruminants. The aim of the first chapter was to: (1) investigate whether non-ruminant wildlife interfacing with dairy sheep and goats of four Greek flocks endemically infected with Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) harboured MAP. We cultured and screened, by polymerase chain reaction (PCR), pooled-tissue samples from 327 wild animals. We also cultured faecal samples from 100 sheep or goats. MAP was detected in samples from 11 sheep, 12 goats, two mice, two rats, a hare and a fox. Only one rat had histopathological findings. The aim of the second chapter was to genetically compare Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) isolates from Greek sheep and goats, their compound feed and litter and the associated non-ruminant wildlife. We genetically characterized the strains by using both the IS1311 polymerase chain reaction (PCR) followed by restriction endonuclease analysis (REA) and the sequence and phylogenetic analysis of a part of the IS900 insertion sequence. Generally, the same MAP type was recovered from feed and litter samples, wildlife and sympatric sheep and goats. The sequence and phylogenetic analysis discriminated 19 MAP strains according to sampling site and showed that interspecies transmission between wildlife and sheep and goats may have occurred.The aim of the third chapter was to estimate and compare strain–, and biologic sample (faeces or pooled-tissue) - specific sensitivities (Ses) of two solid culture media, Herrold’s egg yolk medium (HEYM) and Lowenstein-Jensen (LJ), for Map isolation from Greek dairy sheep and goats. We used a Bayesian approach to estimate the strain-specific Ses. SeHEYM-C-faecal= 17% (95% credible interval: 7, 40) was higher than SeHEYM-S-faecal=2% (0.3, 11). Also, SeHEYM-C-faecal was higher than SeLJ-C-faecal= 4% (1, 12). In pooled-tissue samples the strain-specific Ses did not differ between the two media.In the last chapter the findings of the thesis are summarized and discussed with relevance to both the published research and the future outlook to follow-up research activities

O σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η διερεύνηση του ρόλου των μονογαστρικών αγρίων ειδών και του περιβάλλοντός τους ως δεξαμενής διατήρησης και μετάδοσης του Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) στα πρόβατα και τις αίγες. Αρχικά γίνεται μια ανασκόπηση της βιβλιογραφίας που αφορά τις προσπάθειες για την αποσαφήνιση του ρόλου της άγριας πανίδας ως δεξαμενής διατήρησης και μετάδοσης του MAP στα κατοικίδια μηρυκαστικά. Στο πρώτο τμήμα της διατριβής ο σκοπός ήταν η ανίχνευση του MAP σε μονογαστρικά είδη της άγριας πανίδας, που έρχονταν σε επαφή με πρόβατα και αίγες γαλακτοπαραγωγών φυλών, τεσσάρων ελληνικών, ενδημικά μολυσμένων με παραφυματίωση, κοπαδιών. Καλλιεργήθηκαν και εξετάστηκαν με αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (polymerase chain reaction – PCR) ομογενοποιημένα δείγματα ιστών από 327 άγρια ζώα. Επίσης, καλλιεργήθηκαν δείγματα κοπράνων από 100 πρόβατα και αίγες. Το MAP απομονώθηκε από τα δείγματα 11 προβάτων, 12 αιγών, 2 μυών, 2 επίμυων, ενός λαγού και μίας αλεπούς. Μόνο ένας επίμυς είχε ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις. Στο δεύτερο τμήμα της διατριβής πραγματοποιήθηκε γενετική σύγκριση στελεχών MAP που απομονώθηκαν από ελληνικά πρόβατα και αίγες, από την τροφή και τη στρωμνή τους, καθώς και από συσχετιζόμενα με αυτά μονογαστρικά είδη της άγριας πανίδας. Τα στελέχη χαρακτηρίστηκαν και συγκρίθηκαν γενετικά με τη μέθοδο της IS1311 – PCR ακολουθούμενη από ανάλυση περιορισμού ενδονουκλεασών (restriction endonuclease analysis - REA) και με προσδιορισμό της σημειακής αλληλουχίας του DNA και φυλογενετική ανάλυση των στελεχών σε τμήμα της ένθετης νουκλεοτιδικής αλληλουχίας IS900. Γενικά, τα στελέχη των τρωκτικών, της στρωμνής και της τροφής άνηκαν στον ίδιο τύπο MAP με εκείνα των κατοικίδιων μηρυκαστικών, που απομονώθηκαν από το ίδιο κοπάδι. Η φυλογενετική ανάλυση των στελεχών ομαδοποίησε 19 στελέχη MAP ανάλογα με την περιοχή της δειγματοληψίας και έδειξε ότι πιθανώς έχει συμβεί μετάδοση των στελεχών μεταξύ της άγριας πανίδας και των προβάτων και των αιγών.Στο τρίτο τμήμα της διατριβής πραγματοποιήθηκε εκτίμηση και σύγκριση της ευαισθησίας (Ευ) δύο στερεών καλλιεργητικών υποστρωμάτων, του Herrold’s egg - yolk medium (HEYM) και του Lowenstein-Jensen (LJ), για την απομόνωση του MAP, ανάλογα με τον τύπο του στελέχους και το είδος του δείγματος (κόπρανα ή ιστοί) από ελληνικά γαλακτοπαραγωγά πρόβατα και αίγες. Χρησιμοποιήθηκε η μεθοδολογία επίλυσης κατά Bayes για την εκτίμηση της ευαισθησίας (Ευ) των καλλιεργητικών υποστρωμάτων ανάλογα με τον τύπο του στελέχους. Η ΕυHEYM-C-κόπρανα= 17% (95% Διάστημα αξιοπιστίας: 7, 40) ήταν μεγαλύτερη από την ΕυHEYM-S-κόπρανα =2% (0.3, 11). Επίσης, η ΕυHEYM-C-κόπρανα ήταν μεγαλύτερη από την ΕυLJ-C-κόπρανα=4% (1, 12). Στα ομογενοποιημένα δείγματα ιστών δεν διέφεραν οι Ευ για την απομόνωση διαφορετικών τύπων ΜΑΡ.Στο τελευταίο τμήμα συνοψίζονται τα ευρήματα αυτής της διατριβής και συζητούνται σε σχέση τόσο με τη προϋπάρχουσα δημοσιευμένη σχετική γνώση όσο και με την προοπτική συνέχισης της έρευνας στο μέλλον