Μελέτη του διαφορικού ρόλου των υποδοχέων RPTPβ/ζ και ALK στις βιολογικές δράσεις του αυξητικού παράγοντα HARP και πεπτιδίων του, σε κύτταρα καρκινικών σειρών προστάτη

Abstract

HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide), also known as Pleiotrophin, is a growth factor that is thought to be involved in carcinogenesis. Elevated concentrations of this growth factor are found in many types of tumors, as well as in the plasma of patients with different types of cancer. However, contradictory results have been published concerning the in vitro activities of HARP. Here, we investigated whether the differential expression of HARP receptors, namely RPTPβ/ζ and ALK, is another reason for these controversies. Using the RNAi technology, we stably transformed prostate cancer cell lines DU145 and PC3 to knockdown RPTPβ/ζ or ALK expression. DU145 cells express only RPTPβ/ζ, while PC3 cells express both RPTPβ/ζ and ALK. Our results showed that RPTPβ/ζ inhibits HARP-mediated cellular adhesion and migration, while ALK induces HARP-mediated cellular migration. Investigation of the transduction mechanism revealed that RPTPβ/ζ inactivates Src, Fak, Pten/Akt, and Erk1/2, while ALK activates Akt and Erk1/2. In addition, RPTPβ/ζ knockdown promotes a shift in expression form E- to N-cadherin, and induces the expression of integrin-α5, -αv, -β3, and MMP9. Growth factors can be hydrolyzed by proteases, leading to the production of biological active peptides. Previous studies indicate that HARP is cleaved by enzymes in the extracellular environment, such as plasmin, trypsin, chymotrypsin, and MMP2. Moreover, the resulting peptides exert altered biological functions compared to the whole molecule. Here, we investigated the effect of (P122-131), corresponding to the basic cluster of the C-terminal region of HARP, as well as the effect of P(13-39) and P(65-97) derived from the TSR domains of HARP. Our results demonstrated that P(122-131) interacts with RPTPβ/ζ, inactivates its catalytic activity, and triggers a signal transduction pathway that inhibits DU145 and LNCaP adhesion and migration, while in parallel interferes with ALK or other pleiotrophin receptors inhibiting pleiotrophin-induced cellular adhesion and migration. In addition, P(122-131) inhibits angiogenesis in vivo, as determined by the chicken embryo CAM assay. Furthermore, P(13-39) and P(65-97) interacts with RPTPβ/ζ and inhibits DU145 and PC3 adhesion and migration. Taken together, the results of this study demonstrate the effect of RPTPβ/ζ and ALK on HARP and its peptides-mediated biological actions. Our results support the hypothesis that the overall effect of pleiotrophin depends on the expression profile of its receptors. Concluding, we show that bacterial pleiotrophin is biological active and part of the diversity of pleiotrophin biological actions is due to RPTPβ/ζ and /or ALK and the complex way of their interactions and signaling.

Η HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide), γνωστή και ως πλειοτροπίνη, είναι ένας αυξητικός παράγοντας που η έκφρασή του στα ενήλικα άτομα είναι περιορισμένη σε συγκεκριμένους ιστούς. Ωστόσο, έκφραση ή υπερέκφρασή της έχει παρατηρηθεί in vivo σε διάφορους όγκους και στον ορό του αίματος ασθενών με διάφορες μορφές καρκίνου, καθώς και in vitro σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Παρόλο που οι in vivo βιολογικές δράσεις της HARP είναι αδιαμφισβήτητες, δεν έχει διασαφηνιστεί ο μηχανισμός με τον οποίο ασκεί τις δράσεις αυτές. Επίσης, υπάρχουν πολλά αντικρουόμενα αποτελέσματα αναφορικά με τις in vitro βιολογικές της δράσεις. Στη συγκεκριμένη εργασία διερευνήθηκε το εάν η διαφορετική έκφραση των υποδοχέων της HARP, RPTPβ/ζ και ALK, είναι ένας άλλος λόγος για τα αντικρουόμενα αυτά αποτελέσματα. Χρησιμοποιώντας την RNAi τεχνολογία, δημιουργήσαμε DU145 και PC3 κύτταρα (κυτταρικές σειρές από καρκίνο ανθρώπινου προστάτη), τα οποία σταθερά έχουν μειωμένα επίπεδα έκφρασης του RPTPβ/ζ και του ALK. Τα DU145 κύτταρα εκφράζουν μόνο τον RPTPβ/ζ, σε αντίθεση με τα PC3 κύτταρα που εκφράζουν και τους δύο υποδοχείς. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο RPTPβ/ζ καταστέλλει την επαγόμενη από HARP κυτταρική προσκόλληση και μετανάστευση, ενώ ο ALK επάγει την επαγόμενη από HARP κυτταρική μετανάστευση. Επιπλέον, η μελέτη της μεταγωγής σήματος αυτών των υποδοχέων έδειξε ότι ο RPTPβ/ζ καταστέλλει τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της κινάσης Src, της Fak, της Pten/Akt και των Erk1/2, ενώ ο ALK επάγει την ενεργότητα της Akt και των Erk1/2. Επιπρόσθετα, η μείωση της έκφρασης του RPTPβ/ζ σχετίζεται με την επαγωγή EMT φαινοτύπου, αφού καταστέλλει την έκφραση της E-καντερίνης και επάγει την έκφραση της Ν-καντερίνης, των ιντεγκρινών-α5, -αv και β3, καθώς και της MMP9. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι οι αυξητικοί παράγοντες αποτελούν υπόστρωμα για διάφορα πρωτεολυτικά ένζυμα του κυτταρικού μικροπεριβάλλοντος, με αποτέλεσμα την παραγωγή βιολογικά ενεργών πεπτιδίων που μπορούν να έχουν παρόμοιες ή και αντίθετες δράσεις με το ολικό μόριο. Η πλασμίνη, η τρυψίνη και η MMP2, πέπτουν την HARP και παράγουν πεπτίδια που αναστέλλουν την επαγωγική της δράση. Σύμφωνα με αυτές τις μελέτες, το ενδιαφέρον για την ανακάλυψη πεπτιδίων με αντικαρκινική δράση εντοπίζεται στο καρβοξυτελικό τμήμα της HARP, καθώς και στις δύο κεντρικές περιοχές που παρουσιάζουν ομολογία με τις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες της θρομβοσπονδίνης-1. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε ο μηχανισμός δράσης του P(122-131) και οι βιολογικές δράσεις των P(13-39) και P(65-97). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το P(122- 131) μετά την πρόσδεσή του στον RPTPβ/ζ, μειώνει τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της κινάσης Src, της Fak, της Pten και των Erk1/2 και καταστέλλει την in vitro προσκόλληση και μετανάστευση των DU145 και LNCaP κυττάρων. Επιπλέον, τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι το P(122-131) καταστέλλει αυτές τις διαδικασίες και μετά από τον ανταγωνισμό του με τη HARP για την πρόσδεση όχι μόνο στον ALK, αλλά και σε άλλους υποδοχείς. Τέλος, χρησιμοποιώντας το σύστημα της χοριοαλλαντοϊδικής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας, παρατηρήσαμε ότι το P(122-131) καταστέλλει και την in vivo αγγειογένεση. Παρόμοια με το P(122-131), τα P(13-39) και P(65-97) καταστέλλουν την in vitro προσκόλληση και μετανάστευση των DU145 και PC3 κυττάρων μετά την πρόσδεσή τους στον RPTPβ/ζ. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία καταδεικνύεται ο ρόλος των υποδοχέων RPTPβ/ζ και ALK στον μηχανισμό δράσης του αυξητικού παράγοντα HARP και των πεπτιδίων του. Για πρώτη φορά αποδεικνύεται ότι η ανασυνδυασμένη HARP προκαρυωτικής προέλευσης είναι βιολογικά ενεργή και ότι η δράση της εξαρτάται από τη συνισταμένη των δράσεων που έχει κάθε υποδοχέας της, αντικατοπτρίζοντας τον περίπλοκο μηχανισμό δράσης της HARP και των πεπτιδίων της.