Επιπτώσεις της αλληλεπίδρασης της gp120 V3 HIV-1 και του συνυποδοχέα CCR5 σε κυτταρικό και μοριακό επίπεδο

Abstract

The asymptomatic phase of HIV-1 infection is characterized by a progressive depletion of uninfected peripheral effector/memory CD4+ T cells that subsequently leads to immune dysfunction and AIDS symptoms. Nevertheless, the precise mechanism of by which the virus depletes uninfected CD4+ T cells, the so called bystander effect, remains elusive. Previous studies of our research group suggest that proteins of the viral envelope participate in an “immune-viral” synapse between HIV-1 infected macrophages and CD4+ T cells during antigen presentation. At the synapse, the third hypervariable (V3) domain of HIV-1 envelope glycoprotein gp120 interacts with the chemokine receptor CCR5 inducing an accelerated and enhanced type of apoptosis, called activation-induced cell death (AICD), of the responding CD4+ T cells. It was also demonstrated that the V3-CCR5 interaction is ionic and it is governed by positively charged residues of the V3 peptide and negatively charged peptides on the amino terminal domain of CCR5, the impetus of this interaction being dependent on the charge of V3. It was also shown that synthetic V3 peptides can inhibit the AICD of CD4+ T cells, but also prevent the infection of primary cells by ΗΙV-1. The present study aimed at the unveiling of the initial signaling molecules triggered by the interaction of V3 epitope with the CCR5 receptor which lead the responding CD4+ T cells in immune dysfunction of and the elucidation of the role of V3 epitope in the phenomenon of AICD of uninfected CD4+ T cells. In order to reproduce the biological phenomenon in vitro, we exposed macrophages to linear synthetic lipopeptides from the crown of V3 presented on liposomes and then we induced antigen presentation complex formation with CD4+ T cells via a superantigen presentation system. The impact of the HIV-1/V3 epitope on the transcriptional profile of a CD4+ enriched T cell population during antigen presentation was determined by oligonucleotide microarrays. The microarrays analysis revealed that 440 genes were affected in transcriptional level by the presence of V3 epitope; 378 were up-regulated, 18 of which for at least 10-fold, and 62 were down-modulated. The most significantly up- and down- regulated transcripts could almost entirely be categorized as related to cell cycle the transcriptional regulation. Functional classification of significantly modulated genes and identification of canonical pathways and functional gene networks analysis were performed by an Ingenuity Pathways Analysis (IPA) platform and overrepresentation of functional ontologies by DAVID Bioinformatics Resources. The statistically significant enriched categories of genes and networks identified by IPA were related to cell cycle, gene expression, immune response, infection’s mechanisms, cell growth, proliferation and the process of antigen presentation. Interestingly, the CD28 signaling pathway was significantly subverted by the V3 epitope. Taken together, these results provide evidence for a hyper-proliferative gene expression signature, triggered by V3-CCR5 interaction in responding CD4+ T cells during antigen presentation that could account for AICD of uninfected CD4+ T cells in HIV-1 infection. As cell cycle was prominent among all classifications according to the bioinformatics analysis, we further assessed the impact of V3 epitope on the progression of cell cycle. The cell cycle state of a CD4+ enriched population treated with the V3 epitope was characterized by flow cytometry and an increase in the percentage of cells in S and G2/M phases was observed. The protein levels of MKi67, which plays a pivotal role in cell proliferation, were evaluated by fluorescence microscopy and the observed increase of MKi67 positive T cells in response to V3 confirmed the results of microarrays concerning the transcriptional up-regulation of MKi67. The mRNA expression of CCNB1 gene, which encodes for a regulatory protein expressed in G2/M phase and involved in mitosis, was also elevated in response to V3 suggesting that CCNB1 may play a crucial role in cell cycle deregulation. Of special interest was also the striking upregulation of NOC2L, which is novel gene that affects cell cycle progression regulating transcription of p21 and inhibits apoptosis mediated by p53 and p63. The kinetic analysis of mRNA expression shows that the up-regulation of the transcriptional levels was followed by a sharp down-regulation, that could account for the observed cell death of uninfected CD4+ T cells. Interestingly, it was shown that V3 epitope also subverts CD28 signaling pathway, which is a major driver of positive immune response eliciting sustained expression of IL2. Our studies were focused on the role of the transcriptional factor NFAT5 (nuclear factor of activated T-cells 5) which exhibited extensive transcriptional up-regulation in response to V3 epitope according to microarray analysis. The kinetic analysis of the mRNA expression of NFAT5 by real-time PCR confirmed the increase in the transcriptional levels of NFAT5, and the enhanced protein expression was confirmed by western blotting and flow cytometry. Assessing the functional involvement of NFAT5, it was shown that cyclosporine A, which inhibits the NFAT activationr, interfered with the proliferative promotion of V3 to CD4+ T cells supporting the role of NFAT5 in the V3 phenomenon. The evaluation of the transcriptional expression of IL2, which is characteristic of the activation of CD28 signaling pathway showed enhanced expression of IL2 mRNA confirming the alternation of CD28 signaling pathway by V3 at functional level. Taken together, our results suggest that during antigen presentation the V3 epitope impairs cell cycle progression of CD4+ T cells promoting cells in S and G2/M phase by altering the transcriptional levels of NOC2L, CCNB1, and MKi67 and subverts the CD28 signaling pathway, increasing the transcriptional levels of NFAT5 and of IL2. Due to the clinical relevance of our studies, there was a prerequisite to extend our findings in HIV-1 infected individuals. In experiments performed at Dr Kaufmann’s laboratory at Ragon Institute of MGH, Harvard & MIT in Boston, we assessed the transcriptional levels of selected genes that emerged from transcriptome analysis of our in vitro model in CD4+ T cells of HIV infected individuals with different disease status. The evaluation of the selected genes (NOC2L, MKI67, CCNB1, CCND2, PDPK1, NFAT5, PI3KR1, PAK1, IFI6) in HIV-infected subjects at different state of disease could provide valuable information on the immune components involved in depletion of uninfected CD4+ T cells during HIV infection and enable us to identify the intracellular pathways that are involved in the V3-induced cell death of uninfected CD4+ T cells. A statistically significant reduction in the transcriptional levels of NOC2L was observed in HIV-1 infected individuals in comparison with healthy donors and NOC2L mRNA expression was adversely correlated to viral load. It was also demonstrated that HIV-1 subjects had significantly elevated MKi67 mRNA levels in relationship with HIV-1 negative individuals and there is a significant direct correlation to viral load. Of interest, elite controllers exhibited increased transcriptional levels of MKi67 and CCNB1 genes, which both encode for key molecules in cell cycle progression. Taken together, these data suggest that the cell cycle progression is impaired in HIV-1 infected individuals determining the disease stage. V3 epitope re-immerged as a promising target for neutralizing antibodies when the 3D structure was recently revealed. However, its precise role in HIV infection remains elusive. The delineation of the molecular mechanism by which V3 epitope condemns the uninfected CD4+ T cells to AICD is of major interest as it may account for progressive CD4+ T cell decline during the asymptomatic phase. The findings of the present study provide evidence for a hyperproliferative gene expression signature, triggered by V3-CCR5 interaction in responding CD4+ T cells during antigen presentation. The evaluation of transcriptional levels of genes implicated in V3 signaling in CD4+ T cells in HIV-infected patients of different disease status shed light on genes involved in regulation of cell cycle. Unveiling the key participating molecules in intracellular signaling within the responding CD4+ T cells may provide the impetus to design novel therapeutic strategies such as the salvaging of uninfected T cells from HIV-induced AICD.

Η ασυμπτωματική φάση της μόλυνσης από τον HIV-1 χαρακτηρίζεται από τη σταδιακή μείωση του πληθυσμού των μη μολυσμένων περιφερικών CD4+ Τ κυττάρων που οδηγεί σε ανοσοανεπάρκεια και στην εκδήλωση των συμπτωμάτων του AIDS. Εντούτοις, ο ακριβής μηχανισμός αυτής της κυτταροπαθογένειας δεν είναι πλήρως κατανοητός. Σύμφωνα με μελέτες που έχουν προηγηθεί από την ερευνητική ομάδα μας, έχει προταθεί ότι οι πρωτεΐνες του ιικού φακέλου συμμετέχουν σε μία ιδιότυπη «ανοσο-ιική σύναψη» μεταξύ του μολυσμένου με HIV μακροφάγου και CD4+ Τ κυττάρων κατά την αντιγονοπαρουσίαση. Στη σύναψη, η V3 περιοχή της gp120 αλληλεπιδρά τουλάχιστον με τον υποδοχέα χημειοκινών CCR5 και επάγει μία μορφή ταχείας και ενισχυμένης απόπτωσης, που ονομάζεται AICD (activation-induced cell death) στα αποκρινόμενα CD4+ Τ κύτταρα. Έχει δειχθεί η ιοντική φύση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των θετικά φορτισμένων αμινοξέων στην V3 περιοχής και των αρνητικά φορτισμένων αμινοξέων του ελεύθερου αμινοτελικού άκρου του CCR5 και ότι συνθετικά φορτισμένα V3 πεπτίδια μπορούν να αναστείλουν τον AICD των CD4+ T κυττάρων, αλλά να παρεμποδίσουν την μόλυνση πρωτογενών κυττάρων από τον HIV. Σκοπός της συγκεκριμένης μελέτης ήταν η αποκρυπτογράφηση των αρχικών σηματοδοτικών μορίων που πυροδοτούνται από την αλληλεπίδραση του επίτοπου V3 με τουλάχιστον τον συνυποδοχέα CCR5 προκαλώντας ανοσολογική δυσλειτουργία των αποκρινόμενων CD4+ T κυττάρων και η διερεύνηση του ρόλου του επιτόπου V3 στο μη φυσιολογικό φαινόμενο του επαγώμενου από ενεργοποίηση κυτταρικού θανάτου μη μολυσμένων CD4+ T κυττάρων. Για να αναπαραχθεί το βιολογικό φαινόμενο in vitro, πρωτογενή μακροφάγα εκτέθηκαν σε λιποσώματα τα οποία έφεραν στην επιφάνειά τους γραμμικά, συνθετικά λιποπεπτίδια από το στέμμα του V3 και προκλήθηκε ο σχηματισμός συμπλόκου αντιγονοπαρουσίασης μεταξύ των μακροφάγων και CD4+ T κυττάρων μέσω ενός συστήματος ψευδοαντιγονοπαρουσίασης. Η επίδραση του επιτόπου HIV-1/V3 στο μεταγραφικό προφίλ σε ένα CD4+ εμπλουτισμένο Τ κυτταρικό πληθυσμό κατά τη διάρκεια της αντιγονοπαρουσίασης προσδιορίστηκε με τη χρήση μικροσυστοιχιών συμπληρωματικού DNA. Η ανάλυση αποκάλυψε ότι 440 γονίδια επηρεάστηκαν σε επίπεδο mRNA από την παρουσία του V3 (>2.0 fold-change, p<0,05, t-test): 378 γονίδια αύξησαν τα μεταγραφικά τους επίπεδα, από τα οποία μάλιστα 18 παρουσίασαν αύξηση τουλάχιστον 10 φορές, ενώ για 62 γονίδια παρατηρήθηκε μείωση. Tα γονίδια τα οποία παρουσίασαν τις εκτενέστερες μεταγραφικές μεταβολές σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο και τη μεταγραφική ρύθμιση. Ακολούθησε η λειτουργική κατηγοριοποίηση των σημαντικά τροποποιημένων γονιδίων και η αναγνώριση των τροποποιημένων αναγνωρισμένων μονοπατιών και λειτουργικών δικτύων με τη χρήση της πλατφόρμας Ingenuity Pathways Analysis (IPA) platform και η υπεραντιπροσώπευση λειτουργικών οντολογιών με τη βοήθεια του DAVID Bioinformatics Resources. Οι στατιστικά σημαντικότερες εμπλουτισμένες κατηγορίες και δίκτυα που αναγνωρίστηκαν από το ΙΡΑ αφορούσαν τον κυτταρικό κύκλο, τη γονιδιακή έκφραση, την ανοσολογική απάντηση, τους μηχανισμούς μόλυνσης, την κυτταρική αύξηση, τον πολλαπλασιασμό και την αντιγονοπαρουσίαση. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι επίτοπος V3 μεταβάλλει το μονοπάτι σηματοδότησης μέσω του συνυποδοχέα CD28. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ένα πρότυπο γονιδιακής έκφρασης που υποστηρίζει τον υπερπολλαπλασιασμό, που πυροδοτείται από την αλληλεπίδραση V3-CCR5 στα CD4+ Τ κύτταρα κατά τη διάρκεια της αντιγονοπαρουσίασης και το οποίο θα μπορούσε να λογοδοτήσει για τον AICD μη μολυσμένων CD4+ Τ κυττάρων στη μόλυνση από τον HIV-1. Καθώς ο κυτταρικός κύκλος ήταν η σημαντικότερη λειτουργία του κυττάρου που τροποποιήθηκε από το V3 σύμφωνα με την ανάλυση της βιοπληροφορικής, μελετήθηκε η επίδραση του V3 στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου των CD4+ T κυττάρων. Το στάδιο του κυτταρικού κύκλου ενός CD4+ εμπλουτισμένου κυτταρικού πληθυσμού που έχει επωαστεί με τον επίτοπο V3 προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής και παρατηρήθηκε μία αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που βρίσκονται στις φάσεις S και G2/M όταν τα κύτταρα επωάστηκαν με τον επίτοπο V3. Η πρωτεϊνική έκφραση της MKi67, η οποία διαδραματίζει πρωταγωνιστικό ρόλο στη φάση του πολλαπλασιασμού, εκτιμήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού, και η παρατηρηθείσα αύξηση των MKi67 θετικών Τ κυττάρων σε απάντηση στον επίτοπο V3 επιβεβαίωσε το αποτέλεσμα των μικροσυστοιχιών αναφορικά με τη μεταγραφική αύξηση του γονιδίου ΜΚi67. Τα μεταγραφικά επίπεδα του γονιδίου της CCNB1, το οποίο κωδικοποιεί για μία ρυθμιστική πρωτεΐνη που εκφράζεται στη φάση G2/M ελέγχοντας τη μίτωση, παρουσίασαν αύξηση σε απόκριση στο V3 προτείνοντας ότι η CCNB1 ίσως συμβάλλει καταλυτικά στην απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει και η θεαματική αύξηση των επιπέδων mRNA του NOC2L, ενός πρόσφατα ανακαλυμμένου γονιδίου το οποίο επηρεάζει τη λειτουργία του κυτταρικού κύκλου ρυθμίζοντας τη μεταγραφή μέσω p21 και αναστέλλει την απόπτωση μέσω p53 και p63. Η κινητική μελέτη των επιπέδων mRNA του NOC2L η οποία έδειξε αύξηση των μεταγραφικών επιπέδων που ακολουθείτο από μία απότομη μείωση, θα μπορούσε να διαδραματίζει πρωταγωνιστικό ρόλο στον παρατηρούμενο κυτταρικό θάνατο κατά τη μόλυνση από τον HIV-1. Λόγω του ιδιαίτερου ενδιαφέροντος που παρουσιάζει η τροποποίηση του CD28 συνδιεγερτικού μονοπατιού από τον επίτοπο V3 καθώς ρυθμίζει την ανοσολογική απόκριση αυξάνοντας τη μεταγραφική έκφραση της IL2, μελετήθηκε περαιτέρω το μόριο με τη μεγαλύτερη μεταγραφική αύξηση σύμφωνα με τα δεδομένα των μικροσυστοιχιών, που συμμετέχει στο μονοπάτι αυτό, ο μεταγραφικός παράγοντας NFAT5 (nuclear factor of activated T-cells 5). Η κινητική ανάλυση των μεταγραφικών επιπέδων του ΝFAT5 με ημιποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου επιβεβαίωσε την αύξηση των mRNA του ΝFAT5, και η αυξημένη πρωτεϊνική έκφραση της επιβεβαιώθηκε με western blotting και κυτταρομετρία ροής. Για να επιβεβαιωθεί η βιολογική δράση του NFAT5 στο V3 φαινόμενο, χρησιμοποιήθηκε η κυκλοσπορίνη Α (cyclosporine A, CsA) η οποία παρεμποδίζει την ενεργοποίηση των NFAT. Σε τεχνικές μέτρησης του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, δείχθηκε ότι η CsA επομένως δύναται να αναστείλει το V3 φαινόμενο, γεγονός που υποστηρίζει τον πρωταγωνιστικό ρόλο του ΝFΑΤ5 στο φαινόμενο. Η εκτίμηση των μεταγραφικών επιπέδων της ιντερλευκίνης 2, το τελικό αποτέλεσμα της ενεργοποίησης του CD28 μονοπατιού, απέδειξε αύξηση της μεταγραφικής έκφρασης της ιντερλευκίνης 2, επιβεβαίωνοντας την τροποποίηση του CD28 μονοπατιού από V3 σε λειτουργικό επίπεδο. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης προτείνουν ότι κατά τη διάρκεια της αντιγονοπαρουσίασης το V3 επηρεάζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των CD4+ T κυττάρων μεταβάλλοντας τα μεταγραφικά επίπεδα των NOC2L, CCNB1 και MKi67, με αποτέλεσμα την αύξηση των κυττάρων που βρίσκονται στις φάσεις πολλαπλασιασμού S και της G2/M, και φαλκιδεύει το μονοπάτι του CD28, επιτείνοντας κυρίως τη μεταγραφή των NFAT5 και IL2. Λόγω της κλινικής σημασίας της μελέτης μας, ήταν επιβεβλημένο να επεκτείνουμε τα ευρήματα μας σε άτομα μολυσμένα από τον HIV-1 χρησιμοποιώντας δείγματα αίματος. Σε πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο του Dr Kaufmann στο Ragon Institute of MGH, Harvard & MIT στη Βοστόνη εκτιμήθηκαν τα μεταγραφικά επίπεδα επιλεγμένων γονιδίων που αναδύθηκαν από την ανάλυση του μεταγραφώματος των CD4+ T κυττάρων στο in vitro μοντέλο, σε ασθενείς που βρίσκονται σε διαφορετικά στάδια της ασθένειας. H μελέτη της έκφρασης επιλεγμένων γονιδίων (NOC2L, MKI67, CCNB1, CCND2,PDPK1 NFAT5, PI3KR1, PAK1, IFI6) σε ΗIV-1 μολυσμένα άτομα με υψηλό ιικό φορτίο (VL), σε ΗΙV-1 μολυσμένα άτομα σε θεραπεία, και σε elite controllers αποκαλύπτει πολύτιμες πληροφορίες για τα ανοσολογικά στοιχεία που εμπλέκονται στη δραματική μείωση των μη μολυσμένων CD4+ T κυττάρων κατά τη μόλυνση με τον HIV. Ανάμεσα στα πιο σημαντικά αποτελέσματα ήταν η στατιστικά σημαντική μείωση των μεταγραφικών επιπέδων του NOC2L σε άτομα που έχουν μολυνθεί από τον HIV-1 σε σύγκριση με τα υγιή άτομα, και δείχθηκε ότι η ποσότητα του mRNA συνδέεται αντιστρόφως ανάλογα με το ιικό φορτίο. Επίσης δείχθηκε ότι τα HIV-1(+) άτομα είχαν αυξημένα μεταγραφικά επίπεδα για το Ki67 σε σχέση με τους υγιείς δότες και υπήρχε άμεση συσχέτιση με το ιικό φορτίο. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η παρατήρηση ότι οι elite controllers έχουν υψηλή έκφραση επίπεδο μεταγραφής των γονιδίων Κi67 και CCNB1, τα οποία κωδικοποιούν για μόρια κλειδιά στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν πως ο HIV-1 επηρεάζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των CD4+ T κυττάρων και τοιουτοτρόπως ίσως επηρεάζει την πορεία της ασθένειας. O επίτοπος V3 έχει επανέλθει στο προσκήνιο ως στόχος εξουδετεροποιητικών αντισωμάτων, όταν πρόσφατα προσδιορίστηκε η τρισδιάταση δομή της. Εντούτοις, ο ακριβής ρόλος του V3 παραμένει αινιγματικός. Η σκιαγράφηση των μοριακών μηχανισμών μέσω των οποίων το V3 καταδικάζει τα μη μολυσμένα CD4+ T κύτταρα σε AICD καθίσταστη επιβεβλημένη, καθώς θα μπορούσε να λογοδοτήσει για την προοδευτική ελάττωση των των CD4+ Τ κυττάρων, παρά το γεγονός ότι μόνο το 0,001-0,1% των Τ κυττάρων είναι μολυσμένα. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης προσδίδουν ενδεικτικά στοιχεία για τη διαμόρφωση ενός μεταγραφικού προφίλ που οδηγεί τα CD4+ Τ κύτταρα σε υπερπολλαπλασιασμό από την συνδιέγερση του V3 μέσω του CCR5 κατά τη διάρκεια της αντιγονοπαρουσίασης. Η εκτίμηση των μεταγραφικών επιπέδων γονιδίων που επηρεάζονται από το V3 σε CD4+ T κύτταρα από μολυσμένα με HIV-1 άτομα υπογράμμισε τη ρόλο γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Ο προσδιορισμός των μορίων-κλειδιά που συμμετέχουν στη σηματοδότηση μέσω V3 στα CD4+ HIV, δύναται να οδηγήσει στο σχεδιασμό καινοτόμων θεραπευτικών στρατηγικών κατά του AIDS.