Ιστολογική και ιστομορφομετρική αξιολόγηση της ενσωμάτωσης νανοεπεξεργασμένων οδοντικών εμφυτευμάτων σε κονίκλους μετά από χορήγηση αλ...

Abstract

Bisphosphonates are the main drug class used for diseases which are characterized by skeletal disorders. The more potent N-containing bisphosphonates, such as alendronate (ALN), dominate pharmacotherapy in today’s clinical practice. All bis are incorporated by the skeleton and suppress bone resorption mediated by osteoclasts. This effect is the primary reason for affecting bone remodeling. The process of bone remodeling is crucial for implant integration and long-term stability and functionality. Until today, there is some evidence that bis contribute to implant integration, when osseous disorder - such as osteoporosis- coexists. On the other hand, it is questionable whether bis could enhance this process in healthy subjects, in order to meet new clinical demands of shortened healing time and immediate loading. Current data from literature studying the effect ALN may have on dental implant osseointegration is not sufficient. There are studies concluding alendronate- coated dental implants are responsible for a statistically significant increase in bone density and bone formation occurring in the periimplant region after their placement (Meraw and Reeve 1999, Meraw et al 1999). Only one experiment (Chacon et al 2006) has studied the effect of systemic administration of ALN on dental implant osseointegration in non-osteoporotic rabbits, but the conclusions were based on torque removal values only. The latest research (Blazsek et al 2009) investigating 116 SUMMARY bone neogenesis around an implant inserted in a rat tail vertebra following chronic aminobisphosphonate treatment, showed positive results. The present experimental study was designed to shed light on the effects of ALN on osseous healing of dental implants with nano-treated surface modification in cancellous and cortical bone of rabbits, hormonally resembling healthy postmenopausal women. Materials and methods Animals Thirty two adult (one-year old) female New Zealand White rabbits were used. They had given birth at least one time before their taking part in this experiment. At the time of surgery they weighed a mean of 4±1kg each. The animal study was performed in accordance with the animal experimental ethical guide lines of the European Communities Council Directive of 24 November 1986 (86/609/EEC) and was licensed by the Veterinarian Department of Prefecture of Athens (Certification Number: K/3957). Prior to any surgical procedures, animals were acclimated for a period of observation in order to insure they were appropriate for the experiment. Implants Thirty two screw-type titanium dental nano-implants, treated with CaP, applying the Discrete Crystalline Deposition (DCD) process, were used in this experiment. The implants, commercially known as NanoΤite™ Certain® Microplant ™ (Nanotite, 3i Implant Innovations, Alm Beach Gardens, FL) were 3, 25mm in diameter and 10mm long. Surgical procedure All the animals were subjected to ovariectomy (OVX), in order to simulate a common environment of hormones, resembling that of healthy post- SUMMARY 117 menopausal women. The rabbits were randomly divided into two groups of sixteen animals: saline-treated group (A) and alendronate-treated group (B). Both of them were randomly divided into two healing subgroups (eight animals each), representing 6 and 12 weeks follow-up respectively, after the implant insertion. Immediately after the surgery the rabbits of group B were given the first dose of ALN, using an orogastric catheter. The animals were receiving their weekly dose of 10mg for the whole individual healing period until they were euthanized. One week after the OVX the implants were placed into the left femoral condyle of each rabbit. For the insertion of the implant each animal was immobilized on its back. Preparation of the specimens The animals were kept in separate cages. Immediately after they came out of anesthesia they were allowed to bear their full weight on their legs. During the test periods, the experimental animals’ health remained on a very good level. Following 6 and 12 weeks of healing, animals were pharmacologically euthanized, by an overdose of intravenous administration of sodium thiopental, under general anesthesia (intramuscular injection of midazolam- 2mg/Kg- and ketamine-30 mg/Kg). The implants and surrounding bone were excised immediately after the euthanasia. No clinical signs of inflammation or adverse tissue reactions were observed. Excess tissue of the excised femurs was removed. The bone blocks with the implants were fixed in neutral 10% formaldehyde solution. Radiographs of the distal part of the femur were taken and a disk-like tissue block containing the implant was removed. Its orientation was approximately perpendicular to the long axis of the femur and parallel to long axis of the implant. These blocks were dehydrated in ascending grades of alcohol, and embedded in light-curing resin Technοvit 7200+BPO (Kulzer &Co, Wehrheim, Germany). Using the method described by Donath and Breuner, (Donath and Breuner 1982) and the Exakt cutting and grinding equipment (Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany) the implant-bearing blocks were cut along the long axis of the implant and reduced to a 118 SUMMARY thickness of 30μm. The undecalcified thin ground sections were stained with the Levai - Laczko stain (Laczko and Levai 1975). Under microscopic view (Nikon Mikrophot-FXA, Leitz, Germany), the stained specimens were placed on a motorized stage (Märzhäuser Wertzlar GmbH&Co KG Wertzlar –Steindorf, Germany) and digitally photographed (DMX 1200, Nikon, Tokyo, Japan) at a resolution of 1 pixel equal to 2,21μm. The overlapping images were automatically arranged (stitched) to form overview images of the complete cross-section of the femur using Lucia software (Lucia G 4.71, Laboratory imaging Ltd., Prague, Czech Republic). The photographs were processed with Adobe Photoshop software (Adobe, San Jose, CA) and manually divided into a medullary, periostal and a cortical compartment. For the segmentation and classification of implant and bone, a rule set for the Definiens Developer® 6.02 (Definiens, Munich, Germany) software was devised. This algorithm considered the color and shape of the objects themselves, as well as the relationship to other neighboring objects in contact with them. This automatic classification was corrected and improved afterwards, by visually assigning the few falsely classified areas to bone, soft tissue and the implant. Both sides of the implant were evaluated. Variables measured and computed included: 1. The percentage of the implant surface in contact with mineralized bone (BIC; bone-to-implant contact). 2. The percentage of bone tissue (BV/TV; bone volume per tissue volume) in a 200μm wide zone, parallel to the contour of the implant. Bone volume was measured directly adjacent to the implant, thereby including the areas immediately involved in bone regeneration. The means of BIC and BV/TV were compared separately in the medullar, periostal and cortical compartments of alendronate- and saline-treated groups, at two healing periods (6 and 12 weeks). Statistical analysis The two groups were compared using the Kruskal-Wallis. This non-parametric test was applied because of the deviations of the data. The significance was assigned at the 5% level. SUMMARY 119 Results Histological evaluation Implants showed good integration into the bone tissue surrounding them. The region of interest is an area within a periimplant distance of 200μm in the medullary, the cortical and the periostal compartment, on both sides of the implant. Bone tissue formed as a result of regenerative processes after implant placement consisted in both groups mainly of plexiform bone. Plexiform bone is a combination of woven bone (many large osteocytes) in the centre of the trabeculae and coarse parallel fibred bone (smaller and fewer osteocytes) on their surfaces. Often small, very lightly stained slivers of devitalized old bone were embedded into these trabeculae. In both groups plexiform bone tissue has been replaced to a small degree by secondary lamellar bone. This is achieved by remodelling processes. Proof for this replacement can be found in the presence of cementing lines and hemiosteons. At 6 weeks the size and number of areas of secondary lamellar bone did not differ significantly between the two groups. After 12 weeks the bone tissue in both groups still consisted mainly of plexiform bone. More traces of remodelling were visible and a larger portion of secondary lamellar bone was present than at 6 weeks. Again no great differences in bone quality between the treatment and control group were discernible. On the whole, upon histological evaluation, no obvious differences between the control and treatment group could be detected for both healing periods tested. Histomorphometrical evaluation For the histomorphometrical evaluation the area of interest included the medullary, the cortical and the periostal compartment, on both sides of the implant. The cortical compartment was delimited manually and is in most cases relatively small. The periostal compartment was chosen to be the periimplant region with up to 1mm distance to the border between periostal and cortical bone.

Υπάρχουν δηλαδή ενδείξεις ότι τα διφωσφονικά άλατα συνεισφέρουν στην οστεοενσωμάτωση στις περιπτώσεις που συνυπάρχει κάποιου τύπου ανω- μαλία στον οστικό μεταβολισμό, όπως για παράδειγμα στην οστεοπό- ρωση. Είναι άραγε πιθανό η συστεμική χορήγηση των διφωσφονικών αλά- των να προάγει τη διαδικασία της οστικής επούλωσης γύρω από εμφυτεύ- ματα σε υγιές υπόστρωμα; Σκοπός της εργασίας αυτής ήταν να μελετηθεί ιστολογικά και ιστομορ- φομετρικά το νεοπαραγόμενο οστό γύρω από εμφυτεύματα των οποίων η επιφάνεια έχει επεξεργαστεί με ασβεστοφωσφορικά νανομόρια, παρουσία και απουσία της αλενδρονάτης. Τα εν λόγω εμφυτεύματα τοποθετήθηκαν σε κονδύλους μηριαίων οστών κουνελιών Νέας Ζηλανδίας και εξετάστη- καν 6 και 12 εβδομάδες μετά την εμφύτευση. Υπόθεση εργασίας ήταν ότι η οστεοενσωμάτωση των οδοντικών εμφυ- τευμάτων στα πειραματόζωα που έλαβαν αλενδρονάτη θα ήταν βελτιωμένη σε σχέση με την οστεοενσωμάτωση εκείνων που τοποθετήθηκαν στα πειρα- ματόζωα που δεν έλαβαν αλενδρονάτη, ενώ η παράταση του χρόνου εξέτα- σης από τις 6 στις 12 εβδομάδες ενδεχομένως να έπαιζε κάποιο ρόλο. Για τις ανάγκες του πειράματος χρησιμοποιήθηκαν 32 θηλυκά λευκά κουνέλια τύπου Νέας Ζηλανδίας. Τα πειραματόζωα ήταν ενός έτους και ζύγιζαν 5±1kg. Προηγήθηκαν ωοθηκεκτομές σε όλα μία εβδομάδα πριν την τοποθέ- τηση των εμφυτευμάτων, προκειμένου το πειραματικό μοντέλο να προσο- μοιάσει καλύτερα στο ορμονικό περιβάλλον μετεμμηνοπαυσιακών γυναι- κών. Κατόπιν οι κόνικλοι χωρίστηκαν τυχαία σε 2 ομάδες των 16 ατόμων. Η μία ομάδα, η πειραματική, ελάμβανε αλενδρονάτη (Fosamax των 10mg) μέσω της στοματοφαρυγγικής οδού μία φορά εβδομαδιαίως, αρχής γενο- μένης της ημέρας της ωοθηκεκτομής και έως την ημέρα της ευθανασίας. Η ομάδα μαρτύρων ελάμβανε φυσιολογικό ορό μέσω της ίδιας οδού και με την αυτή συχνότητα. Μία εβδομάδα αργότερα τοποθετήθηκε στον αρι- ΠΕΡΙΛΗΨΗ 113 στερό μηριαίο κόνδυλο κάθε πειραματοζώου ένα εμφύτευμα NanoΤite™ Certain® Microplant ™ της εταιρείας 3i, διαμέτρου 3,25mm και μήκους 10mm. Κάθε ομάδα χωρίστηκε τυχαία σε δύο υποομάδες ισάριθμων κο- νίκλων: οι 8 εξαυτών θανατώθηκαν σε 6 εβδομάδες από την ημέρα της εμφύτευσης και οι υπόλοιπα 8 σε 12 εβδομάδες από την ημέρα της εμφύ- τευσης. Η ευθανασία επιτεύχθηκε με ενδοφλέβια (iv) χορήγηση νατριούχου θειοπεντάλης σε δόση 30mg/kg. Μετά τη θανάτωση των πειραματοζώων ακολούθησε αφαίρεση του μηριαίου οστού και παρασκευή των κονδύλων που παρέμειναν σε διάλυμα φορμαλδεΰδης για μία εβδομάδα κατ’ελάχιστον. Κατόπιν η περιοχή του ενδιαφέροντός μας διαχωρίστηκε σε πολλά τεμάχια κομμένα παράλληλα στον επιμήκη άξονα του εμφυτεύματος. Έπειτα αφυδατώθηκαν βαθμιαία σε ανοδικές αλκοολούχες σειρές και εγκιβωτίστηκαν σε φωτοπολυμεριζό- μενη ρητίνη (Technοvit 7200+BPO, Kulzer &Co, Weirheim, Germany). Με τη μέθοδο των Donath και Breuner (1982) και τον εξοπλισμό κοπής Εxakt (Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany) τα τεμάχια που φέρουν τα εμφυτεύματα κόπηκαν και πάλι σε μικρότερα πάχους 30μm, σε άξονα παράλληλο με τον επιμήκη άξονα των εμφυτευμάτων και έλαβαν χρώση Levai Laczko. Τα χρωματισμένα τεμάχια φωτογραφήθηκαν ψηφιακά (Kodak Professional DCS 420, Rochester, NY) με τη βοήθεια μικροσκοπίου (Nikon Mikrophot-FXA, Leitz, Germany). Η ανάλυση ήταν 1pixel=2,21μm. Με τη βοήθεια του λογισμικού Photoshop (Adobe, San Jose, CA) κωδικοποιήθηκε η περιοχή και διαχωρίστηκε σε σπογγώδες και συμπαγές τμήμα. Για την ιστολογική και ιστομορφομετρική αξιολόγηση χρησιμοποιήθηκε μία αντι- προσωπευτική περιοχή που περιελάμβανε και τις δύο πλευρές του εμφυ- τεύματος.Οι παράμετροι που μετρήθηκαν χωριστά για τη σπογγώδη και τη συμπαγή μοίρα του οστίτη ιστού είναι: 1. η άμεση επαφή οστού – εμφυτεύματος (bone-to-implant contact, BIC), ως ποσοστό της συνολικής εμφυτευματικής επιφάνειας 2. το ποσοστό οστίτη ιστού στην περιοχή, ως αποτέλεσμα του κλάσματος (bone volume per tissue volume,BV/TV). 114 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η ποσότητα του οστίτη ιστού μετρήθηκε στην περιοχή της άμεσης επα- φής με το εμφύτευμα, και σε μια ζώνη πλάτους 200 μm, παράλληλα με το περίγραμμα του εμφυτεύματος, στο σπογγώδες, συμπαγές και περιο- στικό (periostal) τμήμα και στις δύο πλευρές του υπό εξέταση εμφυτεύμα- τος. Το περιοστικό τμήμα αντιστοιχεί στην περιεμφυτευματική περιοχή σε απόσταση έως και 1mm από το όριο περιοστέου-συμπαγούς οστού (Busenlechner και συν. 2008). Τα εμφυτεύματα ενσωματώθηκαν επιτυχώς στον περιβάλλοντα οστίτη ιστό και στις δύο ομάδες πειραματοζώων. Με βάση τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης και υπό τους περιο- ρισμούς της μπορούν να διατυπωθούν συνοπτικά τα παρακάτω συμπερά- σματα: Δεν ανιχνεύτηκε καμία στατιστικά σημαντική διαφορά στην οστεοεν- σωμάτωση οδοντιατρικών εμφυτευμάτων ανάμεσα στην ομάδα της αλεν- δρονάτης και στην ομάδα μαρτύρων, και για τις δύο χρονικές περιόδους επούλωσης. Η αλενδρονάτη επομένως, χορηγούμενη συστεμικά (per os) δεν επηρέ- ασε τα πρώιμα στάδια της οστεοενσωμάτωσης (των 6 και 12 εβδομάδων) των οδοντιατρικών εμφυτευμάτων που τοποθετήθηκαν στον μηριαίο κόν- δυλο κουνελιών.