Ανάλυση της μεταγωγής σήματος μεταξύ των τριών υποτύπων του α2-αδρενεργικού υποδοχέα

Abstract

The three 2-adrenergic receptor (2-AR) subtypes are G-protein-coupled receptors (GPCRs) that mediate the effects of the endogenous catecholamines, epinephrine and norepinephrine. They differ in their pharmacological properties, tissue distribution, regulatory mechanisms and physiological effects. Besides their well established role in neurotransmission and the regulation of sympathetic outflow, 2-ARs have recently been shown in animals in vivo to exert neuromodulatory and neurotrophic actions. In previous studies, we have shown that the three 2-ARs induce subtype-specific (2A< 2B < 2C) morphological neuronal differentiation of rat pheochromocytoma (PC12) cells, stably transfected with the human 2-AR genes. However, the role of individual subtypes and the mechanisms accounting for these findings have not been analyzed adequately in vitro. In the present study, we have demonstrated that -adrenergic receptor signaling in PC12 cells is mediated by the consecutive transactivation of two receptor tyrosine kinases, an early activation of EGFR and a late transactivation of TrkA. The early transactivation of EGFR controls the activation of MAPK and the early Akt activity, whereas the late transactivation of TrkA mediates the subtype-specific (2A< 2B < 2C) sustained activation of Akt. The mechanism of EGFR transactivation by 2-ARs involves stimulation of PLC, AA release, AA metabolism by cytochrome P450-dependent epoxygenase, stimulation of matrix metalloproteinases through src activation and heparin-binding EGF-like growth factor release. On the contrary, the delayed TrkA transactivation does not result via an autocrine/paracrine mechanism involving the release of NGF protein, whereas it is strictly dependent on prior transactivation of EGFR and src activation. In addition our results provide evidence that 2-AR signaling through RTKs transactivation mediates the subtype-dependent differentiating effects of epinephrine, including cell cycle arrest, neurite outgrowth and expression of neurofilament proteins, with the Akt activity to be critical for the subtype-specificity of this outcome.2-AR subtypes and receptors for neuropeptides and growth factors are heavily expressed in the CNS and display overlap in their regional distribution. It is therefore conceivable that 2-ARs may exert neurotrophic effects in vivo by acting synergistically or in permutation with other neurotrophic factors. Furthermore, the crucial role of transcription factor CREB in neuronal plasticity prompted us to investigate the effect of 2-AR subtypes on this specific factor. Our results indicate that 2-ARs promote both phosphorylation and transcriptional activation of CREB in a subtype-specific manner, with order of potency 2B < 2A 2C. The mechanism of 2-AR-induced CREB activation involves the metabolism of AA by cytochrome P450-dependent epoxygenase and subsequent activation of PKA in a subtype-specific manner (2B < 2A 2C), whereas MAPK, PKC and Src negatively regulate the 2-AR-induced CREB transcriptional activity.

Οι τρεις υπότυποι του α2-αδρενεργικού υποδοχέα (α2-AR) είναι υποδοχείς που διασυνδέονται με G-πρωτεΐνες (GPCRs) και διαμεσολαβούν τη δράση των ενδογενών κατεχολαμινών, επινεφρίνη και νορεπινεφρίνη. Διαφέρουν στις φαρμακολογικές ιδιότητες, στην ιστική κατανομή, στη ρύθμιση και στις φυσιολογικές τους δράσεις. Εκτός από τον καλά μελετημένο ρόλο τους στη νευροδιαβίβαση και την ρύθμιση του συμπαθητικού τόνου, οι α2-αδρενεργικοί υποδοχείς έχουν δειχθεί πρόσφατα να ασκούν νευρορυθμιστικές και νευροτροφικές δράσεις in vivo. Σε προηγούμενες μελέτες δείξαμε ότι οι τρεις α2-αδρενεργικοί υπότυποι επάγουν τη μορφολογική νευρωνική διαφοροποίηση των PC12 κυττάρων με υπότυπο-ειδικό τρόπο και συγκεκριμένα με τάξη ισχύος α2A< α2B < α2C. Ωστόσο, ο μοριακός μηχανισμός μέσω του οποίου ελέγχονται αυτές οι δράσεις καθώς και ο ρόλος κάθε υποτύπου δεν έχουν αναλυθεί επαρκώς in vitro. Στην παρούσα εργασία, δείχνουμε ότι η σηματοδότηση των α-αδρενεργικών υποδοχέων στα PC12 κύτταρα μεσολαβείται από την διαδοχική διενεργοποίηση δύο υποδοχέων με ενδογενή ενεργότητα κινάσης τυροσίνης, μία ταχεία διενεργοποίηση του EGFR και μία καθυστερημένη διενεργοποίηση του TrkA. Η ταχεία διενεργοποίηση του EGFR ελέγχει την ενεργοποίηση της MAPK και την πρώιμη ενεργοποίηση της Akt κινάσης, ενώ η καθυστερημένη διενεργοποίηση του TrkA διαμεσολαβεί την υπότυπο-ειδική (α2A< α2B < α2C) και παρατεταμένη ενεργοποίηση της Akt κινάσης. Ο μηχανισμός διενεργοποίησης του EGFR από τους α2-αδρενεργικούς υποδοχείς περιλαμβάνει την ενεργοποίηση της PLC, την απελευθέρωση του αραχιδονικού οξέος και το μεταβολισμό του από την P450-εξαρτώμενη εποξυγενάση, την ενεργοποίηση μεταλλοπρωτεϊνασών μέσω ενεργοποίησης των src κινασών και τελικά την απελευθέρωση του HB-EGF. Αντίθετα, η καθυστερημένη διενεργοποίηση του TrkA δεν είναι αποτέλεσμα ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει την απελευθέρωση του αυξητικού παράγοντα NGF, ενώ είναι απόλυτα εξαρτώμενη από την προηγούμενη διενεργοποίηση του EGFR και την ενεργοποίηση των src κινασών. Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η σηματοδότηση των α2-αδρενεργικών υποδοχέων μέσω διενεργοποίησης υποδοχέων με ενδογενή ενεργότητα κινάσης τυροσίνης (RTKs) είναι υπεύθυνη για την υπότυπο-εξαρτώμενη διαφοροποιητική δράση της επινεφρίνης, περιλαμβανομένης της εξόδου από το κυτταρικό κύκλο, τον σχηματισμό νευριτών και την έκφραση πρωτεϊνών που χαρακτηρίζουν τον νευρωνικό φαινότυπο, με τη ενεργότητα της Akt κινάσης να είναι καθοριστική για την υπότυπο-ειδικότητα αυτής της δράσης. Οι τρεις α2-αδρενεργικοί υπότυποι και υποδοχείς για νευροπεπτίδια και αυξητικούς παράγοντες εκφράζονται ευρέως στο ΚΝΣ και παρουσιάζουν αλληλοεπικάλυψη ως προς την ιστική τους κατανομή. Είναι λοιπόν πιθανό οι α2-αδρενεργικοί υποδοχείς να δρουν συνεργικά ή εν σειρά με άλλους αυξητικούς παράγοντες προκειμένου να ασκήσουν την νευροτροφική τους δράση in vivo. Επίσης, ο καταλυτικός ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα CREB στην ανάπτυξη του Νευρικού Συστήματος μας ώθησε να ερευνήσουμε την επίδραση των α2-αδρενεργικών υποτύπων σε αυτόν τον παράγοντα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι α2-αδρενεργικοί υποδοχείς επάγουν την φωσφορυλίωση και την μεταγραφική ενεργοποίηση του CREB με υπότυπο-ειδικό τρόπο και συγκεκριμένα με τάξη ισχύος α2B < α2A α2C. Ο μηχανισμός ενεργοποίησης του CREB από τους α2-αδρενεργικούς υποδοχείς περιλαμβάνει τον μεταβολισμό του αραχιδονικού οξέος από την P450-εξαρτώμενη εποξυγενάση και την επακόλουθη ενεργοποίηση της PKA με υπότυπο-ειδικό τρόπο (α2B < α2A α2C), ενώ οι MAPK, PKC και Src ρυθμίζουν αρνητικά την επαγόμενη από α2-αδρενεργικούς υποδοχείς μεταγραφική ενεργοποίηση του CREB.