Ο ρόλος των ανοσορρυθμιστικών Τ λεμφοκυττάρων στην ανοσοπαθογένεια και την εξέλιξη της HCV λοίμωξης

Abstract

The immunopathogenesis of chronic hepatitis C (CHC) has been suggested to involve a complex balance of several arms of the immune system, among which T regulatory cells play an important role. The purpose of this study was to investigate the role of CD4+CD25+highFoxp3+ T regulatory cells (Tregs) in the pathogenesis of CHC and the response to treatment in naïve patients. 61 patients were included, 39.3% genotype 1, 4.9% gen.2, 47.6% gen.3, 8.2% gen.4 (assessed with INNOLIPA). Liver biopsy was performed in 59/61. Patients were treated with peg-IFN and ribavirin according to body weight and genotype. In all patients peripheral blood was drawn and viral load was assessed qualitatively and quantitavely (Combas Amplicor, Amplicor Monitor Roche Diagnostics), ALT was measured, and CD4+CD25+highFoxp3+, CD3+CD8+, CD4+, CD4+CD25+, CD4+CD28+ T lymphocyte numbers were determined with flow triple color cytometry (FACS, EPICS XL-MCL,Beckman Coulter) with CD3, CD4 (FITC, Immunotech), CD4, CD8, CD25, CD28 (PE, Immunotech), CD25 (ECD, Immunotech) and Foxp3 (PE, Ebioscience) monoclonal antibodies at 4-timepoints (prior to therapy-Τ0, week 4 or 12 depending on genotype-Τ1, end of treatment-Τ2 and 6 months after the end of treatment-Τ3). Also peripheral blood monocytes were cultured in vitro with PHA. Statistical analysis was performed using paired samples t-test and Mann-Whitney U test. Patients with gen.4 were excluded, 12/15 patients with gen.1 responded and all of gen.2 and 3 patients also. Our results showed that the initial viral load and ALT values were significantly decreased in all time-points, in all of the patients, regardless of genotype or response. The numbers of Tregs did not change significantly between T0 and Τ1 or Τ2, but they were significantly increased in Τ3. A significant increase in their number was also noted from time-point Τ1 to Τ3. Treg numbers in the in vitro cultures did not change significantly. The numbers of CD3+CD8+ T cell subset increased significantly only at Τ3. The numbers of CD4+ T cells were initially significantly increased at Τ1 but later, at Τ3 they were decreased. Similarly, although the numbers of CD4+CD25+ and CD4+CD28+ T cell subsets were both increased in T1, they showed no significant differences at T2 and T3 compared to To. Τhe patients with gen.1 that did not achieve SVR did not show a decrease in their Treg numbers in Τ1 and had a significant increase in their numbers 6 months after the end of therapy. CD4+CD28+ T cell numbers were decreased between T1 and T3 in gen.1 patients that responded. Treg numbers in patients with gen.2 and 3 was significantly decreased in T2 and increased in T3, implicating that they are involved in response to treatment. Patients with gen1 had significantly lower ALT values and smaller Treg numbers in comparison with gen.2 and 3 at T1. The final conclusion is that the pathogenetic role of CD4+CD25+highFoxp3+ Tregs in the peripheral blood of naive patients with CHC seems to be different between gen.1 and gen.2 and 3, but it is not clear whether their fluctuations during treatment could be used as a predictive marker of response.

Η χρόνια παραμονή του ιού της ηπατίτιδας C αποτελεί το συχνότερο αίτιο χρόνιας ηπατικής νόσου παγκοσμίως επιτυγχάνεται μέσω πολύπλοκων ανοσιακών αποκρίσεων μεταξύ των οποίων ενοχοποιείται και η δράση των Τ ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων. Ο σκοπός της μελέτης ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος των CD4+CD25+highFoxp3+ T ρυθμ.κυττάρων (Tregs) στην ανοσοπαθογένεση της χρ.ηπατίτιδας C σε ασθενείς που δεν είχαν προηγουμένως υποβληθεί σε θεραπεία. Συμμετείχαν 61 ασθενείς, 39,3% με γονότυπο 1, 4,9% γον.2, 47,6% γον.3 και 8,2% γον.4 (προσδιορισμός με INNOLIPA). 59/61 υποβλήθηκαν σε βιοψία ήπατος. Οι ασθενείς ακολούθησαν την θεραπεία συνδυασμού με πεγκυλιωμένη ιντερφερόνη και ριμπαβιρίνη αναλόγως του ΣΒ και για το χρόνο που ενδείκνυται με βάση το γονότυπο του ιού. Σε όλους μετρήθηκε στο περιφερ.αίμα το ιικό φορτίο ποιοτικά και ποσοτικά (Combas Amplicor και Amplicor Monitor Roche Diagnostics), η τιμή της ALT και οι CD4+CD25+highFoxp3+, CD3+CD8+, CD4+, CD4+CD25+, CD4+CD28+ T λεμφοκυτταρικοί υποπληθυσμοί με κυτταρομετρία ροής τριπλού φθορισμού (FACS, EPICS XL-MCL, Beckman Coulter) με τα μονοκλωνικά αντισώματα CD3, CD4 (FITC, Immunotech), CD4, CD8, CD25, CD28 (PE, Immunotech), CD25 (ECD, Immunotech) και Foxp3 (PE, Ebioscience) σε τέσσερα στιγμιότυπα (προ θεραπείας-Τ0, την εβδομάδα 4 ή 12 αναλόγως του γονοτύπου-Τ1, στο τέλος της θεραπείας-Τ2 και 6 μήνες μετά το τέλος της-Τ3). Επίσης έγινε in vitro καλλιέργεια των μονοπύρηνων του περιφ.αίματος με PHA για 48 ώρες. Η στατιστική ανάλυση έγινε με paired t-test και Mann-Whitney.Οι ασθενείς με γον.4 τελικά εξαιρέθηκαν, 12/15 ασθενείς με γον.1 ανταποκρίθηκαν και όλοι οι ασθενείς με γον.2 και 3 ανταποκρίθηκαν. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι το ιικό φορτίο και η ALT μειώθηκαν σε όλους τους ασθενείς ανεξαρτήτως ανταπόκρισης ή γονότυπου. Ο αριθμός των Tregs στo σύνολο των ασθενών, δεν παρουσίασε σημαντικές διαφορές στο χρόνο Τ2, παρόλο που αυξήθηκε μεταξύ Τ1 και Τ3. Τα CD3+CD8+ T κύτταρα αυξήθηκαν στον χρόνο Τ3, τα CD4+ T κύτταρα ελαττώθηκαν σημαντικά στο χρόνο Τ3, τα CD4+CD25+ T κύτταρα παρουσίασαν πρώιμη και άμεση ενεργοποίηση και τα CD4+CD28+ T κύτταρα παρουσίασαν σημαντικές διακυμάνσεις. Στους ασθενείς με γον.1 που δεν ανταποκρίθηκαν στη θεραπεία ο αριθμός των Tregs δεν μειώθηκε κατά τη διάρκεια της. Στους ασθενείς με γον.1 που ανταποκρίθηκαν ο αριθμός των CD4+CD28+ T κυττάρων μειώθηκε σημαντικά μεταξύ των χρόνων Τ1 και Τ3. Ο αριθμός των Tregs στους ασθενείς με γον.2 και 3 μειώθηκε σημαντικά στο χρόνο Τ2 και αυξήθηκε στο χρόνο Τ3, συνεπώς τα κύτταρα αυτά συμμετέχουν στην ανταπόκριση. Κατά τη σύγκριση των ασθενών με γον.1 και γον.2 και 3 βρέθηκε ότι οι πρώτοι εμφάνιζαν σημαντικά μικρότερο αριθμό Tregs και τιμή ALT στο χρόνο Τ1. Ο προσδιορισμός των υπόλοιπων Τ λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών ανέδειξε λεπτές διακυμάνσεις και ποικίλες συσχετίσεις οι οποίες είναι δύσκολο να ερμηνευθούν σε σχέση την επίτευξη μακράς ιολογικής ανταπόκρισης (SVR). Οι in vitro καλλιέργειες με μη ειδική διέγερση δεν ανέδειξαν σημαντικά αποτελέσματα αλλά επιβεβαίωσαν την ικανότητα των Tregs να επιβιώνουν και απουσία αντιγόνου του ιού. Το συμπέρασμα της μελέτης όσον αφορά στον παθογενετικό ρόλο των Tregs είναι ότι αυτός διαφέρει μεταξύ των ασθενών με γον.1 και γον.2 και 3, αλλά δεν είναι ακόμη σαφές εάν οι διακυμάνσεις τους στο περιφερικό αίμα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως προγνωστικός δείκτης της επίτευξης SVR.