Συγκριτική μελέτη φωτοσυνθετικών και φωτοπροστατευτικών χαρακτηριστικών σε φύλλα με υψηλό και χαμηλό περιεχόμενο ανθοκυανινών

Abstract

Leaves of some plant species appear transiently red because of the accumulation of anthocyanins, at levels sufficient to mask the green chlorophyll color. Given that leaf anthocyanins absorb also in the visible spectrum (strongly in the green and less in the blue-violet and yellow region), they act as sunscreens attenuating part of the photosynthetically active radiation and hence they compete with chlorophylls for photon capture. Due to this attribute, one of the ascribed roles of leaf anthocyanins is the photoprotection of the photosynthetic mesophyll. Additionally (and regardless of the proposed role) it has been suggested that they shape a particular shade microenvironment in the leaf interior. In order to investigate these two hypotheses, in the present study we monitored the course of photosynthetic and photoprotective characteristics in leaves of the same species with different anthocyanic content. Five species have been used, three of them as main experimental material (Cistus creticus L., Photinia x fraseri Dress και Quercus coccifera L.) and two additional (Ricinus communis L., Rosa sp. L.) for the assessment of the stoichiometry of the two photosystems. In Cistus creticus (L.) transient redness is induced in mature leaves by abiotic environmental factors, i.e. the combination of low temperatures and high light intensity during winter. In the rest species redness is developmentally determined (young red leaves which become red upon maturation). In P. x fraseri and R. communis the color variation concerns leaves of different age from the same individual (comparison of young red and mature green). The rest three species show intra-species variation of the anthocyanic trait. Thus, leaves of the same physiological age from different individuals and phenotypes (occupying the same habitat) were compared. The photoprotective hypothesis of leaf anthocyanins entails that red leaves would be less sensitive against photoinhibition and have a reduced need of non-photochemical quenching, compared to their green counterparts. However, according to our chlorophyll fluorescence measurements with dark adapted samples (OJIP-analysis), anthocyanic leaves did not display a comparative advantage in their photosynthetic function. On the contrary, red leaves of P. x fraseri and C. creticus, apart from their slightly, yet statistically significant, lower maximum PSII yield (Fv/Fm), they also confront higher limitations in the further steps of excitation energy processing and its transformation compared to greens. In both species, a transformation of active PSII centers to non-QA -reducing ones, could be inferred. In Q. coccifera, no differences were observed between leaves of the same physiological age from the two phenotypes in the above parameters. Moreover, chlorophyll fluorescence measurements in light acclimated samples have shown that red leaves have similar (P. x fraseri και C. creticus) or lower (Q. coccifera) PSII effective yield (YII) and similar or higher corresponding non-photochemical energy quenching (YNPQ). It has to be noted, however, that the actual PAR levels penetrating to the red leaf mesophyll are in fact lower compared to their green counterparts, due to anthocyanin absorption of the white and blue actinic light used during these measurements. Accordingly, for the same incident PAR, the opposite trend was expected in red leaves. In C. creticus, measurements performed in the lower leaf side by-pass this problem, since anthocyanins accumulate only in the palisade mesophyll (of the upper side) and the abaxial leaf surface is always green. In that case, red leaves showed a higher need for non-photochemical quenching (YNPQ) and a higher vulnerability to photoinhibition (YNΟ), in spite of the supposed photoprotective function of the overlying anthocyanins. The trend for an enhanced need of non-photochemical dissipation in red leaves is indicated also by the higher investment in “xanthophyll cycle” components (P. x fraseri) and/or the lower EPS values (P. x fraseri and C. creticus) during midday. In addition, during the superimposed winter stress, red leaves of C. creticus proceed to a Chl loss, possibly as an attempt to decrease further the absorbed excitation energy, in spite of the anthocyanic screen. The above results weaken the photoprotective hypothesis for leaf anthocyanins, unless it is assumed either that photosynthesis is not the target for protection or that red leaves would be in a worse position, compared to greens, if anthocyanins were absent. Some of our results support the shade acclimation hypothesis in red leaves, irrespectively of the factor that induces the accumulation of anthocyanins. In all tested species, red leaves display a higher, statistically significant, relative PSII/PSI ratio compared to greens (except of Q. coccifera, where the same was observed as a trend). PSII/PSI ratio declines in parallel with the decrease of anthocyanin accumulation. A higher PSII/PSI ratio is considered as an acclimation to the altered light quality under shade conditions in order to adjust the excitation pressure of two photosystems. Chl a/b was statistically lower in red leaves of C. creticus, Q. coccifera και Rosa sp., while in P. x fraseri and R. communis no differences were observed. A decrease in Chl a/b ratio is a typical shade acclimation feature, indicating an increased ratio of light harvesting antennae per reaction center. Finally, another parameter indicative of shade acclimation is the mean antenna size (calculated as ABS/RC ratio), which was considerably higher in red leaves of C. creticus and P. x fraseri (again in Q. coccifera only a similar trend was observed). Yet, according to the JIP-analysis the antenna size is expressed per active RC, hence the increased ABS/RC ratio could be the combined effect of an increase in the antenna size and a decrease in active PSII centers. The combination of the above results indicates that anthocyanin accumulation in C. creticus, Rosa sp. and Q. coccifera contributes mainly to a higher relative size of LHC. In the case of P. x fraseri and R. communis, the enhanced PSII/PSI ratio of red leaves reflects rather an increase of PSII centers.

Στα φύλλα κάποιων φυτικών ειδών παρουσιάζεται παροδική ερυθρότητα, λόγω συσσώρευσης ανθοκυανινών, η οποία μπορεί να είναι τόσο έντονη που να καλύπτεται το χρώμα της χλωροφύλλης. Δεδομένου ότι απορροφούν και στο ορατό φάσμα (κυρίως στην πράσινη και ελαφρώς στη μπλε και κίτρινη περιοχή) οι ανθοκυανίνες πρακτικώς λειτουργούν ως φίλτρα, αφού απορροφούν μέρος της προσπίπτουσας φωτοσυνθετικά ενεργής ακτινοβολίας και ανταγωνίζονται τις χλωροφύλλες στην απορρόφηση του φωτός. Εξ αιτίας αυτής της ιδιότητάς τους, ένας από τους ρόλους που τους έχει αποδοθεί είναι η φωτοπροστατευτική δράση, ενώ παράλληλα (και ανεξαρτήτως ρόλου που επιτελούν) έχει προταθεί ότι διαμορφώνουν ένα ιδιαίτερο μικροπεριβάλλον σκιάς στο εσωτερικό του φύλλου. Προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανή συνεισφορά των ανθοκυανινών στη φωτοπροστασία αλλά και στην επαγωγή σκιόφιλων χαρακτήρων, στην παρούσα διατριβή παρακολουθήσαμε την πορεία των φωτοσυνθετικών και φωτοπροστατευτικών χαρακτηριστικών, παράλληλα με τη μεταβολή της ερυθρότητας, σε φύλλα του ίδιου είδους που διαφέρουν ως προς το ανθοκυανικό περιεχόμενο. Εξετάστηκαν πέντε είδη, τρία ως κύρια πειραματόφυτα (Cistus creticus L., Photinia x fraseri Dress και Quercus coccifera L.) και δύο ως συμπληρωματικά στον προσδιορισμό της στοιχειομετρίας των δύο φωτοσυστημάτων (Ricinus communis L., Rosa sp. L.). Στο C. creticus, η παροδική ερυθρότητα εμφανίζεται στα ώριμα φύλλα και σχετίζεται με αβιοτικούς περιβαλλοντικούς παράγοντες, συγκεκριμένα το συνδυασμό χαμηλών θερμοκρασιών και υψηλών εντάσεων φωτός. Στα υπόλοιπα, η παροδική συσσώρευση ανθοκυανινών επάγεται από οντογενετικούς παράγοντες (νεαρά κόκκινα φύλλα που πρασινίζουν με την ωρίμανση). Στα P. x fraseri και R. communis, η χρωματική ποικιλομορφία αφορά φύλλα διαφορετικής ηλικίας, που ανήκουν όμως στο ίδιο άτομο (νεαρά κόκκινα-ώριμα πράσινα). Tα υπόλοιπα τρία είδη εμφανίζουν ενδο-ειδική ποικιλομορφία ως προς τον ανθοκυανικό χαρακτήρα, και επομένως συγκρίνονται φύλλα ίδιας κάθε φορά φυσιολογικής ηλικίας, που ανήκουν σε άτομα διαφορετικών φαινοτύπων. Στην περίπτωση που οι ανθοκυανίνες λειτουργούν φωτοπροστατευτικά, αναμένεται τα φύλλα που τις περιέχουν να αντιμετωπίζουν μικρότερο κίνδυνο φωτοαναστολής και να έχουν μικρότερη ανάγκη για μη-φωτοχημική απόσβεση σε σύγκριση με τα αντίστοιχα πράσινα. Ωστόσο, από τις μετρήσεις του in vivo φθορισμού της χλωροφύλλης σε προ-σκοτεινιασμένα δείγματα (OJIP-ανάλυση) δεν διαπιστώθηκε τα ανθοκυανικά φύλλα να διαθέτουν κάποιο συγκριτικό πλεονέκτημα όσον αφορά στη φωτοσυνθετική τους λειτουργία. Αντιθέτως, τα κόκκινα φύλλα των ειδών P. x fraseri και C. creticus εκτός του ότι παρουσιάζουν ελαφρώς, αλλά στατιστικώς σημαντικά, χαμηλότερες τιμές μέγιστης φωτοχημικής απόδοσης του PSII (Fv/Fm) συναντούν και σαφώς μεγαλύτερους περιορισμούς στα μετέπειτα στάδια ηλεκτρονιακής ροής και μετατροπής της ενέργειας σε σχέση με τα αντίστοιχα πράσινα. Και στις δυο περιπτώσεις είναι πιθανό να συμβαίνει απενεργοποίηση κάποιων λειτουργικών ενεργών κέντρων του PSII. Στο Q. coccifera, τα όμοιας ηλικίας φύλλα των δύο φαινοτύπων δεν παρουσιάζουν διαφορές στις ανωτέρω παραμέτρους. Οι μετρήσεις φθορισμού της χλωροφύλλης κάτω από συνθήκες ακτινικού φωτός έδειξαν ότι τα κόκκινα φύλλα έχουν όμοιες (P. x fraseri και C. creticus) ή χαμηλότερες (Q. coccifera) τιμές τρέχουσας φωτοχημικής απόδοσης (YII) και αντίστοιχα όμοιες ή υψηλότερες τιμές μη-φωτοχημικής απόσβεσης (YNPQ). Ωστόσο, λόγω της απορρόφησης των ανθοκυανινών, οι χλωροπλάστες των κόκκινων φύλλων δέχονται πραγματική ένταση φωτός χαμηλότερη της προσπίπτουσας, και επομένως τα ανωτέρω αποτελέσματα είναι αντίθετα των αναμενόμενων. Διαφωτιστικές προς αυτή την κατεύθυνση είναι οι μετρήσεις φθορισμού της κάτω (πράσινης) φυλλικής επιφάνειας σε φωτιζόμενα φύλλα των δύο φαινοτύπων του C. creticus. Σ’ αυτήν την περίπτωση, έχοντας παρακάμψει το πρόβλημα της απορρόφησης των ανθοκυανινών, τα φύλλα του κόκκινου φαινοτύπου εμφανίζουν υψηλότερη ανάγκη μη-φωτοχημικής απόσβεσης (YNPQ) και υψηλότερη ευαισθησία έναντι της φωτοαναστολής (YNΟ), παρ’ όλη τη θεωρούμενη προστασία των υπερκείμενων ανθοκυανινών της άνω επιφανείας. Η μεγαλύτερη ανάγκη μη φωτοχημικής απόσβεσης των κόκκινων φύλλων διαφαίνεται και από την υψηλότερη επένδυση σε συστατικά του κύκλου των ξανθοφυλλών (P. x fraseri) ή την καλύτερη λειτουργικότητα του κύκλου (C. creticus), σε συνθήκες έντονου φωτισμού. Μάλιστα, κατά την καταπονητική περίοδο του χειμώνα ο κόκκινος φαινότυπος του C. creticus εμφανίζει μείωση των περιεχομένων χλωροφυλλών, πιθανόν σε μια προσπάθεια περαιτέρω ελάττωσης της απορροφούμενης ενέργειας διεγέρσεως, παρ’ όλη την ύπαρξη του ανθοκυανικού φίλτρου. Με βάση τα ανωτέρω ευρήματα, η υπόθεση του φωτοπροστατευτικού ρόλου των ανθοκυανινών δεν ενισχύεται, εκτός εάν υποτεθεί είτε ότι ο στόχος για την προστασία δεν συνδέεται με τη φωτοσύνθεση είτε ότι τα κόκκινα φύλλα εάν δεν τις διέθεταν θα ήταν σε πολύ πιο δυσμενή θέση, σε σύγκριση πάντα με τα πράσινα. Όσον αφορά στη συνεισφορά των ανθοκυανινών στην επαγωγή σκιόφιλων χαρακτήρων βρέθηκαν κάποιες ισχυρές ενδείξεις προς αυτήν την κατεύθυνση, ανεξάρτητα από τον παράγοντα που επάγει τη συσσώρευσή τους. Έτσι, και στα πέντε είδη που εξετάστηκαν, παρατηρήθηκε αύξηση της σχετικής αναλογίας PSII/PSI στα κόκκινα φύλλα, η οποία είναι στατιστικά σημαντική (εκτός από την περίπτωση του Q. coccifera) και βαίνει μειούμενη με τη μείωση των περιεχομένων ανθοκυανινών. Αύξηση της αναλογίας PSII/PSI έχει συσχετισθεί με την ποιοτική αλλοίωση του φωτός σε συνθήκες σκιάς και στοχεύει στην εξισορροπημένη διέγερση των δύο φωτοσυστημάτων. Από τον τρόπο προσδιορισμού της (ως F686/F735), η ανωτέρω αναλογία δεν κάνει διάκριση μεταξύ φωτοσυλλεκτικής κεραίας και ενεργών κέντρων των δύο φωτοσυστημάτων. Μία άλλη παράμετρος, που θεωρείται τυπικός δείκτης σκιοφιλίας και μετρήθηκε στο σύνολο των πειραματοφύτων, είναι η αναλογία Chl a/b. Μειωμένη αναλογία Chl a/b σε συνθήκες σκιάς υποδεικνύει αύξηση των φωτοσυλλεκτικών κεραιών σε σχέση με τα ενεργά κέντρα. Στατιστικά σημαντική μείωση της ανωτέρω αναλογίας βρέθηκε στα κόκκινα φύλλα των ειδών C. creticus, Q. coccifera και Rosa sp.. Στα P. x fraseri και R. communis δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ κόκκινων και πράσινων φύλλων. Τέλος, στα είδη C. creticus, P. x fraseri και Q. coccifera προσδιορίσθηκε και η παράμετρος ABS/RC (όπως προκύπτει από την OJIP-ανάλυση), όπου παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική αύξηση στα κόκκινα φύλλα των δύο πρώτων ειδών. Στο Q. coccifera η ίδια τάση δεν είναι στατιστικά σημαντική. Αύξηση της αναλογίας ABS/RC, η οποία αποτελεί θα λέγαμε έναν λειτουργικό περισσότερο δείκτη, μπορεί να αποδοθεί σε αυξημένο μέγεθος της φωτοσυλλεκτικής κεραίας ή/και σε μείωση του αριθμού των λειτουργικών ενεργών κέντρων του PSII. Από το συνδυασμό των παραπάνω αποτελεσμάτων διαφαίνεται ότι στα είδη C. creticus, Rosa sp. και Q. coccifera η επίδραση των ανθοκυανινών εντοπίζεται κυρίως σε αύξηση του μεγέθους της φωτοσυλλεκτικής κεραίας. Στα P. x fraseri και R. communis, η αύξηση του λόγου PSII/PSI αντανακλά πιθανώς μια αύξηση των ενεργών κέντρων του PSII.